Six1、TGF-β、VEGF-C在人喉鳞癌中的表达及相关性分析

张继华,徐文霞，王　来,祖金美

(河北医科大学第一医院耳鼻咽喉科,石家庄 050031)



Six1、TGF-β、VEGF-C在人喉鳞癌中的表达及相关性分析

张继华,徐文霞，王来,祖金美△

(河北医科大学第一医院耳鼻咽喉科,石家庄 050031)

目的检测Six1、转化生长因子-β(TGF-β)及其共同诱导的血管内皮生长因子(VEGF)-C蛋白在人喉鳞癌中的表达，探讨三者在喉鳞癌发生、发展、转移及预后中的意义。方法收集病理学确诊的96例手术后喉鳞癌患者的临床资料和留存石蜡标本。采用免疫组织化学和Western blot法检测喉鳞癌组织中Six1、TGF-β及VEGF-C蛋白的表达情况，并分析上述蛋白表达与喉鳞癌患者临床特征的关系。结果96例喉癌组织标本中，Six1、TGF-β、VEGF-C的阳性表达率分别为84.4%(81/96)、89.6%(86/96)和91.7%(88/96)。Six1阳性表达率在低分化、有淋巴结转移的喉鳞癌患者中较高；TGF-β阳性表达率在有淋巴结转移的喉鳞癌患者中较高，同分化程度无关；VEGF-C阳性表达率在低分化、有淋巴结转移的喉鳞癌患者中较高；人喉鳞癌组织中Six1的表达与VEGF-C表达呈正相关。结论Six1、TGF-β、VEGF-C的高表达可能促进了喉鳞癌的淋巴转移，Six1的表达可能是VEGF-C表达变化的重要影响因素之一。联合检测Six1、TGF-β、VEGF-C对判断人喉鳞癌的转移及预后有重要临床意义。

Six1；转化生长因子-β；血管内皮生长因子-C；喉肿瘤；淋巴转移

喉癌是耳鼻喉科的常见恶性肿瘤，在头颈部恶性肿瘤中发病率较高。淋巴转移是喉癌死亡率居高不下的主要原因，淋巴转移有赖于新生淋巴管的生成，血管内皮生长因子(VEGF)-C被认为是肿瘤新生淋巴管生成的最重要因素[1]。最近研究表明， Six1(sine oculis homeobox homolog 1)、转化生长因子-β(TGF-β)能够共同作用促进多种肿瘤细胞VEGF-C的表达，进一步促进肿瘤淋巴管的生成及淋巴结的转移[2]。但其具体的作用机制尚不明确。本研究对96例喉鳞癌患者肿瘤组织中Six1、TGF-β和VEGF-C蛋白的表达进行了检测，旨在探讨3种蛋白在喉鳞癌淋巴转移中的作用关系，为临床诊治提供理论参考。

1　资料与方法

1.1一般资料收集2013年1～12月河北医科大学第一医院及第四医院收治术前未经放化疗的96例喉鳞癌患者标本，其中声门型38例，声门上型58例；取自距肿瘤切缘大于0.5 cm癌旁组织32例，经病理证实无瘤细胞浸润、炎症表现、细胞增生等病变。96例喉癌标本来源于男性患者79例，女性患者17例；患者年龄32～76岁，平均58岁；其中39例术后病理证实有淋巴结转移，57例无淋巴结转移，按2002年UICC TNM分期标准：39例有淋巴结转移患者中T1N1M06例，T1N2M05例，T2N1M08例，T2N2M09例，T3N1M07例，T3N2M02例，T4N1M02例，T4N2M00例；57例未见淋巴结转移患者中T1N0M014例，T2N0M018例，T3N0M013例，T4N0M012例；临床分期Ⅰ期22例,Ⅱ期28例,Ⅲ期35例，Ⅳ期11例。肿瘤分化程度：高分化45例，中分化16例，低分化35例。所有标本均经两位副高以上职称的病理科医生复查确诊。

1.2主要试剂兔抗人Six1多克隆抗体购自博士德生物工程有限公司，工作浓度为1∶70。兔抗人TGF-β蛋白多克隆抗体购自博士德生物工程有限公司，工作浓度均为1∶50。兔抗人VEGF-C蛋白多克隆抗体购自北京奥维亚生物技术有限公司， 工作浓度为1∶50。S-P试剂盒、DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3方法

1.3.1免疫组织化学染色石蜡包埋组织块做厚度5 μm连续切片，SP法免疫组织化学染色，PBS代替一抗作阴性对照，用已知的阳性病例做阳性对照。主要步骤如下：将切片置于0.01 mol/L、pH6.0的柠檬酸缓冲液中，高温高压热修复抗原2 min。待其温度恢复至室温后，蒸馏水冲洗2次，PBS液浸洗5 min。3%的双氧水孵育10 min，蒸馏水冲洗2次，0.1 mol/L PBS液浸洗5 min。加一抗，用0.1 mol/L PBS代替一抗作阴性对照，37 ℃孵育1 h。0.1 mol/L PBS冲洗3次，每次5 min。加二抗，37 ℃孵育30 min，0.1 mol/L PBS冲洗3次，每次5 min。加DAB显色液显色，显微镜下控制显色时间，自来水终止显色5 min。苏木素复染细胞核5 min，再依次经过1%酸性酒精分化(30 s)、1%氨水返蓝(1 min)、70%乙醇(10 min)、80%乙醇(10 min)、90%乙醇(10 min)、100%乙醇Ⅰ(20 min)、100%乙醇Ⅱ(20 min)、二甲苯Ⅰ(20 min)、二甲苯Ⅱ漂洗(20 min)、中性树脂封片。

1.3.2Western blot常规提取组织蛋白，制备样品，测定各组蛋白的浓度，点样(12%分离胶和4% 浓缩胶)，每个样本总蛋白上样量为60 μg进行电泳，加入预染蛋白Marker，将样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，并将目的蛋白转移到硝酸纤维素膜上；将膜经5% 脱脂奶粉封闭液室温封闭1 h，期间轻轻摇动，之后用TBST溶液清洗3次，每次10 min；将转印膜放入杂交袋内，加入TBST稀释一抗(Six1 1∶70， TGF-β 1∶50，VEGF-C 1∶50稀释) ，封口，4 ℃ 静置过夜。 用TBST 洗膜3 次，每次5 min，将膜放入杂交袋内，加入HRP-山羊抗兔IgG(TBST 1∶1 000稀释) ，封口，室温反应1 h，取出转印膜，TBST 洗膜3 次，每次10 min，进行ECL显色反应，检测各条带光密度值。

1.4免疫组织化学结果判断采用双评分半定量法进行综合评分，高倍视野下根据细胞染色强度和阳性细胞所占比例综合判定。染色强度评分标准为：不着色记 0 分，黄色记 1 分，棕黄色记 2 分，棕褐色记 3分。阳性细胞所占比例评定标准：阳性细胞率小于25%记 0 分，25%～50%记 1 分，51%～75%记 2 分，>75%记 3 分。两种评分相加得出综合得分，0～1分结果为阴性(-)，2 分结果为弱阳性(+)，3～4 分结果为阳性(++)，5～6 分结果为强阳性(+++)。

1.5统计学处理采用SPSS13.0统计软件进行分析，根据数据特征进行卡方检验；用Spearman等级相关性分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结　　果

2.1Six1、TGF-β、VEGF-C蛋白在人喉鳞癌中的表达免疫组织化学检测结果显示：96例喉癌组织标本中，Six1、TGF-β、VEGF-C的阳性表达率分别为84.4%(81/96)、89.6%(86/96)和91.7%(88/96)，见图1。

2.2Six1、TGF-β、VEGF-C蛋白在人喉鳞癌及癌旁正常黏膜中的表达免疫组织化学及Western blot检测结果显示：喉癌组织中Six1、TGF-β蛋白表达明显高于癌旁正常喉黏膜，见表1，图2。

图1　　人喉鳞癌组织中Six1、TGF-β、VEGF-C的表达 (SP，×200)

组织nSix1TGF-βVEGF-C喉鳞癌9681(84.4)86(89.6)88(91.7)癌旁黏膜322(6.3)3(9.4)9(28.1)χ264.25789.76652.798P0.0000.0000.000

A:人喉鳞癌中蛋白表达;B:癌旁正常黏膜中蛋白表达。

图1Western blot检测人喉鳞癌及癌旁正常黏膜中蛋白表达

2.3Six1、TGF-β、VEGF-C蛋白表达与喉鳞癌患者临床病理特征的关系喉鳞癌组织中Six1的阳性表达率在有淋巴结转移的患者中高于无淋巴结转移的患者(P<0.05)，同时Six1在中低分化患者中的阳性表达率高于其在高分化患者中的表达(P<0.05)；喉鳞癌组织中TGF-β的阳性表达率在有淋巴结转移的患者中高于无淋巴结转移的患者(P<0.05)；喉鳞癌组织中VEGF-C的阳性表达率在有淋巴结转移的患者中高于无淋巴结转移的患者(P<0.05)。同时VEGF-C在中低分化患者中的阳性表达率高于其在高分化患者中的表达(P<0.05)。见表2。

2.4喉鳞癌患者肿瘤组织中Six1、TGF-β、VEGF-C表达相关性Spearman等级相关性分析结果显示，喉鳞癌患者肿瘤组织中Six1与TGF-β的表达无明显相关性；TGF-β与VEGF-C表达无明显相关性。Six1与VEGF-C表达呈正相关(P<0.05)。

表2　　Six1、TGF-β和VEGF-C的表达与喉鳞癌患者临床病理学特征的关系

3　讨　　论

喉鳞癌是耳鼻咽喉-头颈外科的常见恶性肿瘤，复发和转移是喉癌死亡率居高不下的主要原因，淋巴转移是喉鳞癌最主要的转移方式。肿瘤新生淋巴管的生成同肿瘤的转移密切相关，同新生血管形成相似，肿瘤新生淋巴管生成有赖于肿瘤微环境各种因子的共同作用，在众多因素之中，VEGF-C被认为是肿瘤新生淋巴管生成的最重要因素之一。VEGF-C是近年来发现的具有促进新生淋巴管生成作用的VEGF 家族新成员，又称淋巴管生长因子，VEGF-C是一种分泌多肽，可由血管内皮细胞、淋巴管内皮细胞、肿瘤细胞及其间质细胞产生，通过自分泌或者旁分泌方式发挥生物学作用[3]。VEGFR-3主要存在于淋巴管内皮细胞，是VEGF-C 的特异性受体。研究表明，VEGF-C 能够通过其特异性受体VEGFR-3 介导肿瘤新生淋巴管生成，在淋巴结转移中起着重要的作用[4]。

TGF-β是一种具有多种生物学功能的细胞因子，相对分子质量约为25×103的同源二聚体。目前研究发现，在哺乳动物中存在3 种TGF-β的异构体:TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，其中TGFβ1 是含量最丰富，表达最多的亚型。TGF-β1主要通过以下3种方式发挥其生物活性，Smad 通路、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated proteinkinases，MAPK)途径及Wnt通路。TGF-β1有促进血管生成，诱导免疫抑制及促进肿瘤细胞的侵袭和转移等多种生物学功能。尤其在肿瘤发生、发展的进程中，起到了促进肿瘤血管生成、细胞浸润、转移以及免疫抑制的作用[5]。研究表明，TGF-β1在胃癌、肺癌、乳腺癌、口腔癌等多种肿瘤组织中呈现高表达，其表达与肿瘤的分化程度、淋巴结转移、预后密切相关[6-7]。

Six1基因编码产物属于复合同源异型蛋白家族一员，是一个转录调节蛋白,调节着其下游很多基因的表达,包括编码Cyclin D1、Cyclin A1和Ezrin等一系列能够调节细胞增殖、生存与运动的基因[8]。Six1在多种组织生长、发育过程中起着极其重要的作用，其在多种非肿瘤性成熟组织中仅有少量表达，而在恶性肿瘤组织中常表现为过表达。研究表明，Six在乳腺癌、卵巢癌、肝细胞癌中表达明显增强，并且同肿瘤的不良预后密切相关[9-10]。

本研究结果显示，Six1、TGF-β及VEGF-C 3种蛋白在人喉鳞癌组织中均出现了阳性表达，尤其是Six1、TGF-β蛋白表达同癌周正常黏膜相比出现了明显的增强，提示Six1、TGF-β及VEGF-C同喉鳞癌的发生、发展密切相关。同时研究结果显示，在有淋巴结转移组中Six1、TGF-β及VEGF-C蛋白的阳性表达率明显升高，同无淋巴结转移组相比差异有统计学意义，提示Six1、TGF-β及VEGF-C的高表达可能是促进喉鳞癌淋巴结转移的重要因素。

研究结果显示，Six1阳性表达率在低分化鳞癌患者中较高，同时，VEGF-C阳性表达率在低分化的鳞癌患者中也出现了升高，同高分化的鳞癌患者相比，差异均有统计学意义，相关性研究结果显示，Six1的表达与VEGF-C表达呈正相关，即低分化鳞癌中VEGF-C表达的升高，同Six1表达增强有关。有研究结果显示[11]，Six1能够通过增强TGF-β途径而变相刺激VEGF-C的表达，进一步促进肿瘤淋巴管的生成及淋巴结的转移[11-14]。推测人喉鳞癌中高表达的Six1通过TGF-β途径增强了VEGF-C的表达，进一步促进了喉鳞癌的淋巴结转移，但其在人喉鳞状细胞癌中具体的作用机制，及其与TGF-β的关系尚待进一步研究。

本文对Six1、TGF-β及VEGF-C在喉鳞癌淋巴管生成及转移中的作用做了初步探讨，结果提示，Six1/TGF可能成为抑制喉鳞癌淋巴管生成及转移的潜在治疗靶点。

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Expression of Six1,TGF-β and VEGF-C in patients with laryngeal squamous cell carcinoma and their correlation analysis

ZhangJihua，XuWenxia,WangLai,ZuJinmei△

(DepartmentofOtorhinolaryngology,FirstHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang,Hebei050031,China)

ObjectiveTo detect the expressions of Six1,TGF-β and their common induced VEGF-C in human laryngeal squamous cell carcinoma,and to explore their significance in the occurrence,development,metastasis and prognosis of laryngeal squamous cell carcinoma. MethodsThe clinical data and preserved paraffin samples of 96 patients with laryngeal squamous cell carcinoma confirmed by postoperative pathology were collected.The protein expression of Six1,TGF-β and VEGF-C was determined by adopting immunohistochemistry and Western blotting.ResultsThe positive expression rates of Six1,TGF-β and VEGF-C in the laryngel squamous cell carcinoma tissue samples were 84.4%(81/96),89.6%(86/96)and 91.7%(88/96)respectively.The positive expression rate of Six1 was significantly higher in the patients with poor differentiation and lymph node metastasis;the positive expression rate of TGF-β was significantly higher in the patients with lymph node metastasis and had no relationship with the degree of differentiation;the positive expression rate of VEGF-C was significantly higher in the patients with poor differentiation and lymph node metastasis;there was a positive correlation between expression of Six1 and VEGF-C in the laryngel squamous cell cancer tissue.ConclusionThe high expression of Six1,TGF-β and VEGF-C may promote lymphatic metastasis of laryngeal squamous cell carcinoma.Six1 expression may be one of the important influencing factors of the expression change of VEGF-C.The combined detection of Six1,TGF-β and VEGF-C has an important clinical significance for judging the metastasis and prognosis of LSCC.

Six1;TGF-β;VEGF-C;laryngeal neoplasms;lymphatic metastasis

张继华(1978-)，主治医师，硕士，主要从事头颈肿瘤及鼾症的研究。△

，E-mail:ZJMei@126.com。

R739.65

A

1671-8348(2016)20-2789-03

2015-12-25

2016-03-08)

论著·临床研究doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.20.017