生物技术应用于角蛋白降解的潜力以微生物及其酶改善羽毛与其它角蛋白的营养价值作为家禽饲料的资源

A.A.Onifade，N.A.Al-Sane， A.A.Al-Musallam，S.Al-Zarban　著张本民　译



生物技术应用于角蛋白降解的潜力以微生物及其酶改善羽毛与其它角蛋白的营养价值作为家禽饲料的资源

A.A.Onifade，N.A.Al-Sane， A.A.Al-Musallam，S.Al-Zarban著
张本民译

摘要：生物酶技术的进步，如蛋白溶解酶，有望为家禽羽毛的低能耗生物转化技术提供帮助。可以将毛从严重的污染物转变为营养升级的富含蛋白质的家禽饲料。最近，在自然与感染方面提供了最新的生物角蛋白水解信息纲要，强调生物技术改善羽毛营养价值的可能性，同时也可替换传统热解法处理羽毛。有相关支持证据证明羽毛生物法处理后其营养价值提高，氨基酸成份的多样化，从老鼠和小鸡的生长研究中也获得了可观的结果。参考本文的结论，建议将羽毛蛋白或其它角蛋白通过生物技术提高其营养价值，改变其应用途径，将其作为家禽饲料的来源。

关键词：生物技术；角蛋白微生物降解；营养改善；家禽羽毛

1　引言

家禽羽毛占家禽体重的5% ～7%，是一种废弃物，但作为动物饲料又具有应用的潜力和限制。尽管羽毛对鸟类来说具有重要作用，但在离开了鸟的身体后，它们的生物学利用似乎不太理想。家禽羽毛可能组成了自然界中最丰富的角蛋白资源。家禽在被人们食用后，其羽毛就被当作废弃物堆积起来。因此废弃物就产生了很大的污染影响，尤其随着全球家禽类产品的增长。

可以理解，家禽羽毛中大量有潜在使用价值的蛋白与氨基酸（如表1），可以用作动物饲料，这使得羽毛资源循环利用成为了动物营养学家感兴趣的课题。因为羽毛作为蛋白饲料，在价格和替代性上都具有潜力。然而，羽毛利用的限制主要是其不容易消化，生物学价值低，以及缺乏一些有营养价值的必须氨基酸，如蛋氨酸、赖氨酸、精氨酸、色氨酸（Baker et al，1981；Papadopoulos et al，1985；Dalev et al，1997）。同时，羽毛组成的氨基酸是多变的（Wang and Parsons，1997）。另外，随着家禽年龄增长，其毛中总必需氨基酸含量下降，尤其是蛋氨酸、赖氨酸、精氨酸，而总非必需人氨基酸相对增加（Stilborn et al，1997）。天然羽毛蛋白的营养缺陷主要来源于维持羽毛蛋白结构刚性的氨基酸组成与分子结构。同样的原因也可以解释天然角蛋白不能被大多数蛋白水解酶降解。蛋白链中大量存在的α螺旋（α角蛋白）或β折叠（β角蛋白）形成超螺旋多肽链，从而使羽毛具有很强的机械稳定性与抗蛋白酶水解性。大量双硫键的形成也使多肽链的交联度提高。

表1　处理与未处理羽毛粉中蛋白与氨基酸含量

大量的半胱氨酸促进了双硫键的形成。多肽链中的氢键，疏水作用以及超螺旋的稳定性进一步促进了角蛋白的强度和耐水解性。

然而，生产易消化蛋白粉的传统方法是热降解法。根据Papadopoulus（1989），Latshaw et al.（1994）和Wang and Parsons（1997）可知，热处理对营养的改善有限，必需氨基酸像赖氨酸、蛋氨酸和色氨酸会遭受损失，并且会形成非营养氨基酸如溶素丙氨酸、羊毛硫氨酸等（表1）。

在有限的营养改善背景下，考虑到羽毛传统加工的热能耗成本，从营养改善，环境友好和谐，生物资源最优化以及成本有效化入手探索一种替代性技术是合理的。

涉及到微生物及其酶的生物技术方法是一种概念上合理的处理技术。然而，还没有文献记录角蛋白水解微生物的工业应用前景，尤其是强调角蛋白酶产品、性能和其水解的机理和缺陷的文献。因此，为了促进生物技术处理羽毛将其用作动物饲料，本文综述了生物法水解角蛋白的最新信息。羽毛营养价值升级可以生产出高蛋白饲料，从而可以大大节约家禽饲料中大豆和鱼粉的使用。此外，可以预测，羽毛的生物转化会有益于养禽业、人类以及环境。

2　微生物角蛋白水解和角蛋白酶产品

2.1自然界中角蛋白水解的证据

尽管角蛋白非常稳定，但在自然界中羽毛也不会积累，因此可证明确实存在天然的角蛋白分解者或食用者。从人类或家禽的蹄、指甲、角质层、角、头发等角蛋白部分的致病性皮肤真菌和生长（感染）可以获得进一步证据，或许会是自然界中角蛋白降解的一个更好的研究方面。皮肤真菌一种微生物，可以寄生于活体动物的角质基层中。当此类微生物在含有角蛋白的介质中培养时，它们可以将角蛋白基质作为碳源和氮源而食用。皮肤真菌在角蛋白基质中的生长说明它们有能力合成降解复杂角蛋白的蛋白水解酶。

2.2微生物角蛋白降解以及它们生物技术应用的理由

很多科研工作者（Yu et al，1969；ElmayergiandSmith，1971；Takiuchi et al，1984；Asahi et al，1985；Wawrzkiewicz et al，1987；Abdel-Hafezand El-Sharoumy，1990；Malviyaet al，1992；Santos et al，1996；SimpanyaandBaxter，1996；Singh，1997）已经证明和报道过很多微生物都能分解角蛋白，这些微生物中大多数是真菌和细菌。一些腐生菌和寄生菌可以降解角蛋白（Safranek and Goos，1982）。还有很多新孤立的微生物表现出降解角蛋白的性能。最近，Lin et al.（1995）测序并表达了ker A基因，它能翻译出地衣芽孢杆菌PWD-1 97%序列一致的角蛋白水解酶。

观察角蛋白底物的天然降解与寄生虫感染降解，在实验室条件下进行重复性实验，结果表明，作为动物饲料通生物技术提高羽毛利用是可靠的。这与Lin，Dozie和Santos等人的断言一致。

生物技术在羽毛加工上的应用具有以下重要意义。第一，微生物的培养和角蛋白酶的活力可能会改变羽毛角蛋白的结构。这就有可能改变对食用动物消化酶的抵抗性（Elmayergi and Smith，1971；Barabas，G.等，未公开结果，1986；Benedek等，1985；Willianms and shih，1989）。此外，可以有从微生物蛋白质的生物量的羽毛粉，可能是互补或添加剂的营养富集。Barabas，G等（未公开发表结果，1986）发现，与未发酵羽毛相比，发酵羽毛中赖氨酸、蛋氨酸和精氨酸含量更高，得出结论，不仅羽毛角蛋白可以作为蛋白来源，微生物也可以。Earlier，Elmayergi和 Smith（1997）已经报道过，通过S.fradiae的一种蛋氨酸分泌突变体发酵的羽毛蛋氨酸和赖氨酸含量有少量增加。第三，氨基酸的生产也是可行的，尤其是饲料级的赖氨酸和其它来自于羽毛微生物发酵产生的氨基酸（MohammedEl-Akied，1987；Williams和Shih，1989）。表2和表3提供了发酵羽毛营养改善（氨基酸含量增加）的证据。

2.3角蛋白降解微生物的生态学

角蛋白降解微生物在自然界普遍存在，尽管倾向于靠角蛋白基物生长。或许研究最透彻的就是皮肤癣菌因为大多数研究者对病理学很感兴趣（Grappel和Blank，1972；Higuchi等，1981；Wawrzkiewicz等，1987，1991；Apodaca和Mckerrow，1989；Hanel等，1991；Porro等，1997）。Geophilllic皮肤寄生真菌得到了很大关注（Abdul-Fatah等，1982；Al-Musallam，1988；）。角蛋白降解微生物已经从污泥中分离（Ulfig和Korcz，1983，1994）。一种嗜动物性皮肤真菌发癣菌对鸡毛有高度专一性（Wawrzkiewi cz等，1987）。

具有角蛋白降解能力的非寄生真菌也被分离来对它们的酶进行提纯和角蛋白水解性评估（Malciya等，1992，1993a，b；Dozie等 ，1994）。 Williams和Shih从混合了粪便与鸡毛的消化池中分离了B型地衣杆菌。从土坑壤中分离了链霉菌sp.A11，可产生解朊和角蛋白水解活性（Mukhopadhyay和Chandra，1990）。Santos等人1996年报道了烟曲霉菌，这是一种在人体，鸟类和其它动物中普遍存在并伺机靠空气传播的病原体，将鸡毛作为其唯一的碳和氮源。

表2　微生物处理与未处理样品的氨基酸组成

表3　发酵与未发酵羽毛粉中挑选氨基酸浓度

角蛋白降解微生物在不同生态和环境条件下生长，并且溶解角蛋白基物和其它复合蛋白基物的能加很宽泛。微生物主要是通过合成和分泌蛋白酶将底物降解和分解为可吸收的小分子营养素。然而，有相关文献已经报道了具有角蛋白水解活性的蛋白内切酶或细胞结合酶（Yu等，1971；Lamkin等，1996）。同时对于它们在复合蛋白底物中的分子机理的理解仍远不够。

2.4角蛋白降解酶的特性

通过能够降解角蛋白的微生物在细胞内或外加工释放出的特性蛋白酶命名为角蛋白酶或角蛋白水解酶。这种酶与其它类似的蛋白水解酶相比，水解复合底物的活性更好，从而就区分了角蛋白酶与其它蛋白酶或肽酶。

多数角蛋白酶在很大程度上是诱导性的，需要角蛋白作为外源诱导物。某些微生物的角蛋白酶有消抑制作用，如念珠菌、白色念珠菌 （Kapica和 Blank，1957，1958和金孢子菌（DOZIE等，1994）分化带来他们从组成前分泌表达的细胞结合的角蛋白酶。

许多角蛋白酶在细胞外是有活性的，从合成物的细胞内位点释放出。然而，与细胞相关活力的证据蛋白酶已有报道癣菌（Yu等，1971），和一种被充分研究过的角蛋白降解微生物毛癣菌（Lamkin等，1996）。但T.rubrum的内切酶对蛋白质底物具有宽的选择范围，不像T.gallinae。

本文献描述了不同微生物对角蛋白的水解活力和酶底物的专一性。这可能是方法论和物种不同的原因。例如，Lin等1992年发现从B.地衣杆菌中提取的蛋白酶可以水解所有被测的蛋白底物，包括牛血清蛋白、胶原、弹性蛋白和羽毛角蛋白。与上述一致，Bockle等1995年观察了从鸡毛不同可溶底物（酪蛋白与明胶）与不可溶底物（天然与热压处理）所含肽的释放情况。相反，Dozie等1994年报道了一种亲热性角蛋白水解酶。这种酶从C.keratinophllum中获得，只水解角蛋白，但对酪素、牛血清蛋白或角蛋白粉无水解活力。这表明分离的酶对角蛋白底物具有专一性。从另一个角度，Bockle 等1995年发现，在40～70℃范围内用角蛋白降解S.pactum的培养滤液可以将完整鸡毛分解，远超过了生理需求，然而，纯化酶的溶解率还不到底物的10%。

高度专一性细胞内角蛋白酶通 过T.gallinae加 工 释 放（Wawrzkiewicz等，1987）。从一些角蛋白降解微生物中提取的特征角蛋白酶的物理化学性能总结在表4中。

2.5微生物角蛋白水解的机理

角蛋白微生物水解的基本是一种蛋白降解的过程，因为底物（角蛋白）本质上就是蛋白质，也就说蛋白重量占95%。尽管角蛋白酶的物理化学性能不同，但它们对角蛋白具有相同作用这一点毋庸置疑。大多数角蛋白水解酶特性可以作为蛋白酶，对角蛋白有活性。然而，对于角蛋白水解的重要机理和角蛋白降解微生物的新陈代谢还不太清楚。尽管对角蛋白酶的动力行为缺乏完整理解，但很多证据证明以下流程存在的可能性。

2.6机械的角蛋白水解

这只用于真菌和菌丝体的生产，角蛋白降解微生物。机械角蛋白水解可以理解为是由角蛋白底物或菌丝压力引起的角蛋白降解。Malviya等1992注意到，在细胞外发现角蛋白酶活性之前角蛋白就开始水解了，而且降解与菌丝体生长有关。这或多或少预示了机械降解。真菌菌丝体生长与伸长对复合底物产生压力或作为完整的角蛋白水解机理，机械降解的证据已被预先讨 论 过 （Wawrzkiewicz等1987）。

表4　从一些角蛋白降解微生物中提取的角蛋白酶的性能

真菌对宿主的入侵结合了机械压力与酶的水解。通过Figueras等最近的研究，在不考虑成分结构角质化的前提下，使用超微结构显微照片可以观察出真菌垂直侵蚀毛发的能力。菌丝的机械渗透是有必要的，有利于暴露出更多酶解肽键的反应位点。

从可获得的证据来看，或许可假设机械角蛋白降解促进了酶的水解，实际上当菌丝产生外切蛋白酶时更是这样。机械水解和酶水解和协同作用或许发生在起始过程之后。然而，纯化角蛋白酶的初始化能力，持续羽毛降解的能力也许会对以上假设产生质疑。

2.7硫解

因为羽毛粉中半胱氨酸含量较高，才出现了硫解的标志。可以理解，羽毛中含有半胱氨酸的优势就是通过形成双硫健使生物分子结构更加稳定。大从数研究工作者已经认为角蛋白降解的一种可能机理就是双硫键的断裂。然而，验证性研究在这方面很缺乏。

2.7.1硫解证据

在角蛋白的降解过程中，Kunert的调查对硫解提供了深刻的理解。从 Ruffin等和Malviya等的研究中也获得了贡献性证据。双硫键是角蛋白具有突出稳定性与抗降解性的主要原因。只有通过双硫键断裂使蛋白变性，角蛋白才可以完全水解，大家对此达成共识。

根据Kunert（1992），癣菌和非癣菌将代谢出的自由的或结合的半胱氨酸作为硫源和氮源（Ziegler等1969）。通过真菌代谢的胱氨酸产物是无机硫和其它中间产物。Kunert（1992）认为过量的硫以氧化态的硫酸盐和亚硫酸盐形式排泄回介质中。根据下面反应式，在中性至碱性pH范围内，亚硫酸盐与胱氨酸反应，生成半胱氨酸和硫磺基半胱氨酸。

根据Kunert（1992），结合在蛋白质上的胱氨酸也会发生这种反应，包括角蛋白。因此由于亚硫酸盐的释放，角蛋白在被蛋白酶降解之前就已经变性了，这就导致了双硫键的分解。Kunert，Malviya等人提供了双硫键断裂与角蛋白分解同时进行的充实证据。实事上，Malviya等人发现只有超过一半的角蛋白被降解后才能在培养介质中检测到角蛋白。这也就意味着角蛋白有非酶或非水解方式的降解。在角蛋白培养液中出现像磺化半胱氨酸，硫代硫酸盐，硫酸盐以及半胱氨酸这样的硫解产物进一步证明双硫键断裂。然而，很多研究者几乎未检测到中间产物。对于这种现象的解释是真菌优先将半胱氨酸作为硫源。Malviya 与Mohammed El-Akied的研究表明培养液中残留半胱氨酸量持续下降，很明显是因为被真菌代谢消耗。

此外，当加入DDT，DMSO，巯基乙醇盐，苏糖醇等还原剂时可以加强角蛋白水解，这就可以提供物理化学的证据。为了确认亚硫酸盐分泌降解角蛋白先于真菌蛋白酶降解角蛋白，Kunert比较了五种还原剂磺酸钠、半胱氨酸、谷氨酰胺、巯基乙醇和苏糖醇对微孢菌蛋白酶活性的影响效果。结果表明，亚硫酸钠在浓度为3.78 mg/mL时，蛋白酶活性提高最多，达到2.9倍。半胱氨酸，巯基乙醇，谷氨酰胺的效果逐步下降，并且浓度在0.3～1.0 mmol时效果最好。效果最差的是苏糖醇。Kunert发现，24 h内，胱氨酸桥键断裂32%、66%和97%并且转化为硫磺基半胱氨酸后，水解效果分别增加3.7、29和43倍。Kunert讨论了获得的结果，从而揭示出随着硫解程度增加，蛋白水解的敏感性迅速增加并且底物的溶解也可以从微观证明和重量测定。Bockle等人也证明了添加DDT对细菌蛋白酶混合物和纯角蛋白酶的角蛋白水解活性有催化效果。作者还发现如果没有1% 的DDT加入，角蛋白降解率只有大约10%，然而加入后能够达到70%。此前，Takami等人发现巯基乙酸盐催化时，pH12，温度70℃，1 h内就可将毛完全溶解。并且，在无还原剂的情况下，蛋白酶几乎无角蛋白水解活性。Sinha等人还报道了S.fradiae的两种丝氨酸蛋白酶，在加入DDT后蛋白酶活性增强。加入巯基乙酸盐时，S.pactum的蛋白酶无活性，但加入DDT后有活性。这就表明，微生物酶对能还原双硫键的化学试剂具有不同反应。

其它验证性间接数据也有，两种非专一性蛋白酶胰蛋白酶和链霉蛋白酶硫解天然羊毛相同的降解效果，这可以作为验证性的间接数据。Everett之前也报道了一种类似的发现。组织化学反应也揭示出在硬角蛋白降解的位点上有大量硫磺基团。然而，不同微生物的硫解能力不同，这或许与它们寄生潜能的差别相关。

2.8蛋白水解

然而，角蛋白的水解阶段或许被过度简化了，并且与肽键水解类似，角蛋白酶的敏感性不同。不同的相对分子质量、活化剂以及最适环境条件（pH，温度）表明仍缺乏酶解蛋白机理的相关知识。的确，非专一蛋白酶降解硫化角蛋白的能力使角蛋白酶的专一性进一步复杂化。这种矛盾在纤维素、甲壳素、多糖这类复杂有机化合物的微生物代谢中普遍存在。

但是，与其它蛋白酶相比时，微生物角蛋白酶的高水解性是一个突出的因素。此外，纯角蛋白对长链和复杂分子的特殊偏爱也对支持角蛋白专一性提供了补充证据。角蛋白酶对底物的专一性也暗示了不同作用方式的可能，但仍然有待了解。

2.9角蛋白水解的反应顺序

对角蛋白降解提出精确的反应顺序是有困难的。然而，对于真菌和放线菌，大概从菌丝的生长开始，接着分泌破坏双硫键亚硫酸盐，最后蛋白水解。过了初始阶段，几个过程同时进行，微生物也仍在生长。当有细菌体、纯酶或粗酶加入时，或许是一种不同的降解机理。这基本上需要角蛋白底物的分解。Kunert经过大量研究证实了真菌存在时角蛋白降解的假设路径，当使用纯酶时，角蛋白酶分离纯化后的结果可以从表面上说明可能的机理。也很可能是一种单独的作用模式，或许不会适用于所有类型的角蛋白降解微生物。

2.10羽毛粉的微生物处理：生物技术应用的可能性

大多数研究者同意作为饲料蛋白羽毛（角蛋白）的微生物转换代表了一种改善羽毛使用价值微生物技术。通过在羽毛中培养角蛋白降解微生物，接着在细胞外分泌角蛋白酶，可以达到羽毛的生物降解。不用微生物单独使用含有角蛋白酶或粗酶的培养滤液，或着单独使用纯酶也可达到羽毛的生物降解。

2.11羽毛粉营养改善的证据

Elmayergi和 Smith的研究为我们作了先驱工作，他们评价了S.fradiae发酵后羽毛粉的氨基酸的营养补充情况。尽管发酵产品的蛋氨酸、赖氨酸和色氨酸含量仍很低，但与未发酵产品相比，蛋氨酸含量增加（表3）。Elmayergi和Smith表示羽毛发酵后所有氨基酸的浓度均大大提高。然而，通过喂养试验得出的结果表明发酵与未发酵羽毛粉的营养价值无太大区别（表5）。这也就解释了产品不能用于鸡类的原因。通过补充蛋氨酸以达到生物需求继续实验，即给肉鸡喂食分离的大豆，最终肉鸡的生长率发生了明显的变化。在一个类似的研究中，Barabas，G等人发现与完整羽毛相比微生物发酵的羽毛粉中赖氨酸、蛋氨酸和精氨酸含量更高（表2）。作者分析了两组老鼠喂养试验，发现喂食羽毛水解物的老鼠体重未减少，而喂食少蛋白食物的老鼠体重减少。尽管喂食羽毛粉的老鼠可能因为蛋氨酸缺乏而有体重下降的可能，但这些研究也可确认羽毛水解物的可消化性和使用性。从他们的研究中可以得出结论，不仅羽毛粉（角蛋白）可以当作蛋白质喂食动物，同时产酶菌的生物量也可以。

2.12粗角蛋白酶的使用

Lee等人报道了粗角蛋白酶作为饲料添加剂首次使用。角蛋白酶从地衣芽孢杆菌中获得。他们发现，添加了角蛋白酶后原毛总氨基酸的可消化性从30%增加到66%，而商品毛从77%增加到了99%。在第二个以8天为基准的实验中，对年龄三周大肉鸡分别喂食大豆粉、商业羽毛粉、角蛋白酶补充处理的羽毛粉，肉鸡的日增长量分别为66 g，50 g，56 g。从两个实验可以得出结论，添加角蛋白酶可以提高羽毛产品的可消化性，这样就扩大了角蛋白酶在增强羽毛粉营养方面的应用。

2.13纯角蛋白酶的使用

莱纳大学J.C.H Shih和他的同事获得了纯角蛋白酶作为饲料补充的大量应用证据。为了降低酶的自分解，研究者最近所作的努力是将从地衣杆菌分离的纯角蛋白酶固化。固化角蛋白酶对不可溶的羽毛角蛋白和可溶性的酪素都表现出水解活性。而且与未固化角蛋白酶相比表现出更高的热稳定性和耐酸性，因此增加了其在更多应用上使用的潜能。

2.14生物技术方法对羽毛营养改善的建议途径

考虑到生物技术应用于羽毛营养改善具有很大潜能，在羽毛加工上，微生物技术的应用范围如下：

（1）获得完全的羽毛结构降解。通过化学处理或微生物处理或几种方法结合处理达到硫解是可行的。需要全面实施对外部内部以及培养过程中辅因子的研究，因为这些辅因子或许会优化酶的催化作用。

（2）加强羽毛粉的营养价值，尤其是蛋氨酸和赖氨酸的含量。可能以下任何生物技术工具的结合都是相关的。

1）像赖氨酸这种主要有限氨基酸的转肽作用或氨基酸结合或共价结合作用。

表5　喂食未发酵与发酵羽毛粉生长小鸡的影响

2）通过角蛋白降解微生物的突变或蛋白质工程进行基因操控。

3）角蛋白酶基因在无害微生物的翻译，因为很多活性角蛋白水解微生物具有致病性。

（3）使用一种联合方法设计出一种微生物复合酶很有意义，这种方法能将角蛋白水解酶与肽解酶进行共同加工。也需要考虑结合能分有限氨基酸（蛋氨酸和赖氨酸）的细菌作为联合成员的可能性。从混合培养物中发现了很多这种微生物协同作用的例子，如在动物饲料中添加益生茵，又如微生物纤维素酶复合物用作饲料添加剂。能产生多组分酶复合物的真菌将会是理想的考虑对象。

（4）使微生物在高温下获得稳定性是生物技术应用的先决条件，并且在中性条件下具有活性也是有益的。或许在较高的培养温度下并且通过使用具有还原性的添加剂（化学试剂）可以获得较高的角蛋白水解率。有关文献报道说，酶中一些二价金属的稳定效应导致了它们的高活性。

（5）进一步为角蛋白酶产品筛选具有极高活性的非致病微生物，以及酶在无需分离和纯化条件下的使用。它们的生物量可能对最终产品的蛋白质和氨基酸含量有贡献。

（6）通过对皮肤杆菌致病机理知识的整理综合深刻了解了角蛋白结构降解的机理。这种合作性研究将会对家禽羽毛的营养优化产生有效的生物技术策略。

3　结论

对家畜来说，家禽羽毛和其它角蛋白是具有潜在价值的蛋白饲料资源，由于鸟类羽毛的结构功能使其缺乏必需氨基酸，并且消化性不好。天然角蛋白降解微生物的存在使微生物酶技术成为可能。相比传统热降解处理方法，微生物酶技术可以得到营养更平衡，消化性更好的产品。此外，微生物酶技术更低能更环保。

参考文献略。

致谢：非常感谢Mr Y.A.Fasasi提供研究上的帮助。