肿瘤生物标志物在肺癌患者检测中的临床意义及研究进展

王会中　任成山　金发光



·综述·

肿瘤生物标志物在肺癌患者检测中的临床意义及研究进展

王会中1任成山2金发光3

400038 重庆，第三军医大学学员

【关键词】小细胞肺癌；非小细胞肺癌；肿瘤生物标志物；临床意义

肺癌(lumg cancer)是全球范围内与癌相关致死的首要因素，2012年流行病学统计学数据(GLOBOCAN2012)显示世界范围内新增肺癌患者180万例，约占所有恶性肿瘤28%[1-3]。2015年，估计有1 987 909例新增肺癌患者，预计因肺癌死亡者将达1 732 185例[4]。肺癌的发生率和病死率逐年呈上升趋势，已成为危害人类健康的第一杀手[5]。我国的肺癌发生率一直很高，有报道显示，如果不控制吸烟和固体燃料的使用无明显改变，预计到2030年我国将有1 800万例死于肺癌[6]。肺癌分为小细胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)和非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)。NSCLC有多种类型的上皮肺癌，NSCLC占肺癌中的80%～85%[2,7-8]。根据组织学类型，最常见的NSCLC类型为鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma)、大细胞癌(large cell carcinoma)和恶性细胞癌(adenocarcinoma)等[5]。肺癌不但发生率高，而且预后较差。其原因肺癌在被确诊时多数已属于中晚期，失去了外科根治性手术治疗的良机。因此，对于肺癌患者早期发现，早期获得诊断，早期治疗是提高肺癌临床疗效和提高肺癌生存率的关键。近年来发现有关肿瘤标志物(tumor marker)或肿瘤生物标志物(tumor biomarker)的监测在肺癌早期诊断中有重要价值，其操作简单、方法无创、结果快速及可动态监测等优点，越来越多地被广泛应用于肺癌患者的早期诊断中。现就将近年来临床上常用的肿瘤生物标志物在肺癌患者诊断中的意义及进展进行综述。

一、肺癌肿瘤生物标志物的概念及意义

肿瘤生物标志物又称肿瘤生物标记物。肿瘤生物标志物是肿瘤组织代谢和分泌的分子产物，即可以成为肿瘤诊断的分期及肿瘤分组的指征，并能反映肿瘤的发生、发展，以及用于对肿瘤治疗的监控、预测复发的一类物质[9-11]。肿瘤生物标志物存在于肿瘤患者的细胞、组织、血液、体液和排泄物中，尤以血液中含量较高。并能够用免疫学(immunology)、化学(chemistry)及生物学(biology)的方法进行检测。由于单项肿瘤生物标志物的敏感性及特异性较低，因此，临床上常采用多项肿瘤生物标志物法对肿瘤患者进行检测[12]。肿瘤生物标志物表达水平异常往往早于临床影像学表现，越来越多地被临床应用于肺癌全过程监测，表现出其特定的临床应用价值[13]。

肿瘤生物标志物的检测有助于肺癌的早期发现，因此为肺癌的治疗创造了条件，对于降低肺癌患者的病死率是至关重要的。肿瘤生物标志物涵盖了大部分临床医疗应用的生物分子，包括蛋白质、基因物质，如DNAs、甲基化DNAs、RNAs、miRNAs、低聚糖(oligosaccharides)、脂质(lipids)、代谢物(metabolites)等。因为癌症是一种反映癌细胞内部基因与蛋白质变化的异质性疾病。但是，由于蛋白质是体内生化过程中的主要功能单位，因此几乎所有的药品监督机构认可的肿瘤生物标志物都是蛋白质标志物[14]。

肿瘤生物标志物主要包括：癌胚抗原(carcinoembryonis antigen, CEA)、细胞角蛋白19片段(cytokeratin 19 fragments, CYFRA21-1)；针对NSCLC的鳞状上皮细胞癌抗原(squamous cell carcinoma antigen, SCCA)、神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase, NSE)；针对SCLC的胃泌素释放肽前体(progastrin-releasing peptide, ProGRP)以及表皮生长因子受体(epidemal growth factor receptor, EGFR)；嗜铬粒蛋白A(chromogranin A, GgA)；循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTCs)。

肺癌肿瘤生物标志物监测的临床意义，主要是可望对肺癌患者的早期发现，对肺癌的普查、筛查；肺癌患者的早期诊断、鉴别诊断与临床分期；肺癌患者的手术、化疗及放疗疗效的监控，以及肺癌患者复发的指标评估，对于肺癌患者的预后判断，寻找不明来源的转移性肺癌(metastatic lung cancer)的原发病灶等有重要的临床意义。

二、肺癌主要肿瘤生物标志物

1. 癌胚抗原：癌胚抗原(carcinoembryonis antigen, CEA)是一种癌胚蛋白，相对分子质量为150×103～300×103，由641个氨基酸组成，正常的由结肠柱状细胞和杯状细胞分泌CEA[15]。主要产生于胎儿发育阶段的胃肠组织中，一般不在成人组织中表达。因此，成人血清中CEA升高可作为临床检测的肿瘤标志物。CEA通过CEA编码基因去阻遏一些肺癌细胞中过度表达。对于肺癌而言，血液CEA水平升高，与肺癌治疗反应成反比。因此，CEA被用来对肺癌复发，预测存活率并不理想[16]。CEA升高不仅与肺癌相关，也与结肠癌(colorectal carcinoma)、胃癌(carcinoma of stomach)、胰腺癌(pancreatic carcinoma)、乳腺癌(breast carcinoma)、甲状腺髓样癌(medullary thyroid carcinoma)以及其他一些非肿瘤性疾病如胰腺炎(pancreatitis)、肝硬化(hepatic cirrhosis)、溃疡性结肠炎(ulcerative colitis)[17]、克罗恩病(Crohn′s disease)、慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease)、甲状腺功能减退(hypothyroidism)相关[18]。CEA用于肺癌的早期诊断并不可靠，因为结肠癌时CEA水平亦有改变，也可用于结肠癌分级。血清CEA水平降低可以作为客观肿瘤反应的敏感性与特异性标志物，也可作为CEA升高达基线水平的晚期NSCLC患者进行化疗的敏感性指标。最近有16项研究，进行Meta分析，评估了NSCLC 4 296例患者术前血清CEA水平与存活率的相关性[19]，表明NSCLC患者术前血清CEA过度表达与总存活率预后不良密切相关[20]。

2. 细胞角蛋白19片段： 细胞角蛋白19片段(cytokeratin 19 fragments, CYFRA 21-1)是由多种正常上皮细胞和癌上皮细胞分泌产生，主要存在于肿瘤细胞的单复层上皮的胞质中，细胞凋亡后以溶解片段的形式释放于血清中[21]，与NSCLC在内的上皮细胞癌相关，且常与肺鳞状细胞癌相关。因为CYFRA是结构蛋白，存在于上皮细胞中包含角蛋白的中间丝，所以其降解后能够在肺癌患者血液中测出的可溶性片段，可以作为生物肿瘤标志物[22]。其他CYFRA包括组织多肽抗原及组织多肽特异性抗原。研究发现，CYFRA 21-1与肺癌患者反应与预后相关，但无法用于区别癌症患者与呼吸疾病患者。CYFRA 21-1对于NSCLC的敏感性在23%～70%之间[23-24]。最近一项研究检测了655例肺癌患者与237例良性肺部疾病患者血清中的CYFRA 21-1，研究结果显示，CYFRA 21-1对于肺癌诊断的敏感性与特异性分别为43%与89%[25]。近期针对31项涉及6 400例患者的相关研究所做的Meta分析表明，高浓度血清CYFRA 21-1与NSCLC患者总存活率(overeall survival, OS)的不良预后相关，混合危险比(hazard ratios, HRs)为1.60(P<0.001)[26]。CYFRA 21-1是检测肺鳞癌的首选指标，化疗后鳞癌患者CYFRA 21-1水平较化疗前明显下降，CYFRA 21-1水平降低60%以上可作为化疗尤其是放疗预后可靠的替代标志物[27-28]。

3. 鳞状上皮细胞癌抗原： 鳞状上皮细胞癌抗原(squamous cell carcinoma antigen, SCCA)是一种结构细胞质蛋白，存在于子宫、子宫颈、肺、头颈等鳞状上皮细胞癌的细胞浆中，特别在非角化癌的细胞中含量最高。SCCA在NSCLC患者血液中水平明显升高。具有转移潜能的肺癌患者血液中SCCA水平也明显升高。NSCLC敏感性从15%到55%不等[29]。一项研究分析了肿瘤标志物(SCCA、NSE与CA125)对481例可进行手术的NSCLC患者的预后价值，表明SCCA水平高的患者总体存活率明显低于鳞状细胞肺癌患者[30]。最近一项研究对164例一期NSCLC患者体内的六种肿瘤标志物(CA125、CA19-9、CEA、NSE、CYFRA25-1和SCCA)进行了检测，研究结果表明，血清CYFRA21-1水平是总体5年成活率的独立的预后因素，而包括SCCA在内的其他五种标志物未显示差异性[31]。另一项研究也表明30%的NSCLC患者体内SCCA水平升高，50%的NSCLC患者体内CYFRA21-1水平升高。在肺癌转移患者体内，SCCA敏感性仅为13%，而CYFRA21-1的敏感性跃升为74%[32]。由于对其病症的敏感性较低，血清SCCA水平检测作为NSCLC的诊断与预后指标效率较低。

4. 神经元特异性烯醇化酶： 神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase, NSE)又被称为烯醇酶(enolase)或γ-烯醇酶(γ-enolase)，其为参与糖酵解途经的烯醇化酶中的一种，催化2-磷酸甘油酸裂解生成水及烯醇式磷酸丙酮酸[33]。这种酶首先在神经细胞中发现，就肺癌而言，SCLC可能有神经内分泌根源，所以在SCLC患者血清中发现NSE水平升高。NSE对于SCLC检测的敏感性高达74%[34]。一项对200例肺癌患者的研究中，对照组为90例良性肿瘤患者与150名健康人，NSE特异性为98%，而敏感性仅为23%，NSE的SCLC阳性检出率最高[35]。最近有学者对11项研究，SCLC患者3 500例，对照组3 340例，进行Meta分析显示，对于SCLC患者而言，高水平NSE对于整体存活率的危险比是低水平NSE的1.74倍，表明NSE水平高的患者可能整体存活率更低[36]。另一项Meta分析提示，NSCLC患者的血清NSE水平并无预后意义[37]。除NSE之外，另两种循环神经内分泌标志物嗜铬粒蛋白A(chromogranin A, CgA)与ProGRP同样有意义。有学者对SCLC患者检测CgA>56 ng/ml，ProGRP>58 pg/ml，NSE>19 ng/ml，显示对SCLC有预后价值[38]。另一组检测肺癌患者的四种肿瘤标志物：CYFRA 21-1、CEA、NSE以及结合珠蛋白(haptoglobin, HpG)，发现CYFRA21-1、CEA、NSE与HpG的敏感性分别为42%、41%、23%和44%，特异性分别为98%、99%、98%与91%[39-41]。

5. 胃泌素释放肽前体： 胃泌素释放肽前体(progastrin-releasing peptide, ProGRP)是一种更为稳定的胃泌素释放多肽生化前体，由具有神经内分泌根源的SCLC产生[33,42]。有学者将循环ProGRP作为潜在的SCLC诊断标志物[43-45]。一项综合研究显示了SCLC患者的ProGRP截断值[43]，该研究检测了273名健康者，176例良性病变与良性肿瘤患者，200例SCLC患者，294例NSCLC患者，93例大细胞未分化肺癌患者，35例SCLC与NSCLC混合患者，21例类癌患者，以及189例其他恶性肿瘤患者的血清ProGRP水平。SCLC患者、SCLC与NSCLC混合患者的ProGRP水平显著高于其他受检对象(P<0.0054)。SCLC患者的ProGRP水平与疾病程度及患者的抽烟习惯显著相关。在SCLC与良性病变的鉴别诊断中，ProGRP敏感性为85%，特异性为97%。根据特异性95%的ROC曲线，血浆ProGRP区别SCLC与其他疾病的诊断敏感性为84%，区别SCLC与其他良性疾病的诊断敏感性约为87%。

临床研究表明，ProGRP在SCLC患者临床诊断中的敏感性和特异性均较高。独立应用时，ProGRP在局限期SCLC患者临床诊断中的敏感性为60%～70%，广泛期SCLC患者诊断中的敏感性为75%～90%，均高于NSE[47]。一项Meta分析结果显示，ProGRP对SCLC患者诊断的敏感性和特异性分别为71.6%和92.1%[48]，提示血清ProGRP是诊断SCLC患者一个较好的肿瘤标志物[33]。但由于肾功能不全的患者ProGRP的水平也有升高，故检测ProGRP的同时要注意监测SCLC患者的肾功能，以免造成假阳性结果[49]。ProGRP区别SCLC与肺部良性病变的敏感性为78%，而NSE只有48%；特异性98%，ProGRP和NSE区别SCLC与NSCLC的敏感性分别为76%和38%[50]。

6. 表皮生长因子受体： 表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)是最重要的分子生物肿瘤标志物之一，特别是对基因突变预测及肺癌靶向治疗的疗效预测。按照常规检测肺癌患者的EGFR基因突变，通常发生于第19、第21外显子，可以预判患者是否符合接受酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors, TKIs)治疗的条件。这种遗传倾向是治疗晚期肺癌的重要步骤，可以合理针对晚期NSCLC患者进行靶向治疗。EGFR阻滞剂在临床上用于靶向抗癌治疗，将EGFR突变作为预测生物标志物也促进了对更多靶标的发现。美国食品药品管理局2011年正式批准克里唑蒂尼(crizotinib)靶向疗法，克里唑唑蒂尼是一种间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase, ALK)抑制剂，现已应用于临床实践。对于肿瘤隐匿EML4-ALK染色体易位的NSCLC患者，在肺癌患者体内发现EML4-ALK基因融合可作为克里唑蒂尼靶向治疗的良好生物标志物。但是所有的靶向治疗尽管在初期都有疗效，然而随着耐药的发生，患者将不可避免地经历肿瘤进展(tumor progression)。目前学者们正在研究一些分子，以期在治疗EML4-ALK基因重排的SCLC时服克里唑蒂尼的抗药性[51-52]。

尽管EGFR是变异最为频繁的基因，且对EGFR基因作DNA变异分析后就可运用靶向疗法，但仍应通过实验检测患者体内的可溶性EGFR是否可以用作血清肿瘤生物标志物。作为接受TKI厄洛替尼(erlotinib)治疗的NSCLC患者的结果预测指标，高可溶性EGFR(>57 ng/ml)和CEA(>5 ng/ml)浓度与NSCLC患者的较高总体存活率显著相关[53]。在EGFR基因突变且血清蛋白水平升高被检出的情况下，EGFR基因突变状况与可溶性EGFR水平的结合与更长的无进展存活期显著相关。另一项血清mRNA研究中，血清EGFR mRNA拷贝数与肿瘤数量及临床分期相关(P<0.05)。EGFR mRNA肺癌诊断敏感性与特异性分别为71%与86%。通过与hTERT结合，EGFR mRNA即成为诊断与评估肺癌临床分期的生物标志物[54]。

7. 嗜铬粒蛋白A：嗜铬粒蛋白A(chromogranin A, GgA) 是一个相对分子量为48×103的酸性物质，由439个氨基酸组成的酸性可溶性蛋白，是神经肽类家庭中的一员，因其半衰期长而成为评估整个神经内分泌系统活性的强有力指标，是诊断神经内分泌肿瘤的标志物，在心血管疾病中的作用也越来越受到关注。CgA基因最早从人胎肝基因库中分离出来，主要包括15 000个外显子。CgA广泛存在于神经内分泌细胞和组织的致密核心颗粒中，包括肾上腺髓质、垂体前叶、视网膜、内分泌性肠细胞、甲状腺、内分泌胰细胞、大脑、交感神经系统、肾上腺能神经以及胆碱能神经如脊髓的运动神经元等。CgA可以释放入血循环中，绝大多数神经内分沁来源的肿瘤都会出现血浆中CgA的水平升高[33,35]。在神经内分泌肿瘤的诊断中，CgA是具有诊断价值的非特异性肿瘤标志物。有学者研究显示SCLC患者血清中可见CgA的释放，并对其区分神经内分泌和非神经内分泌肿瘤的作用进行了评估，CgA诊断SCLC的敏感性为57.1%[55-56]。

肺腺癌、肺鳞癌、大细胞癌等NSCLC亦有神经内分泌功能，CgA与Ⅲ期NSCLC的神经分泌相关，可作为评估神经内分泌活化的指标，血浆CgA高表达患者的中位生存期也较长。在对SCLC患者进行CgA诊断价值的研究中发现，由于检测中选用的抗体不同，以及抗体所对应的CgA表位不同，或是选用的标本类型不同，可使CgA的敏感性有一个较宽的波动范围[57]。但尽管不同的研究结果有一定的差异，CgA还是显示出了它的优点。近来研究发现CgA的敏感性为61.0%高于NSE的57.1%，特别是在局限性SCLC中。且CgA的检测不受溶血的影响，而NSE在溶血时会显著增高，造成假阳性的结果。CgA的水平还与肿瘤的转移、负荷以及生存相关，并能判断肺癌患者的预后[42,55]。

8. 循环肿瘤细胞： 循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTCs)是存在于外周血中的各类肿瘤细胞的统称，在肿瘤的转移和发展中起着重要作用[58]。大部分CTCs在进入外周血发生凋亡或被吞噬，少数CTCs能够逃逸并锚着发展成为转移灶，而增加恶性肿瘤患者病情进展。由于CTCs在外周血中浓度水平较低，因此临床上需要特殊的技术来检测CTCs。主要分为免疫磁珠富集技术和免疫荧光技术[59]。Cell Search系统检测技术中有一种新型的富集技术叫Can Patrol法，即免疫去除结合纳米法[60-63]。CTCs以不同形态存在于外周血中，即有游离的单个CTCs，也有聚集成团的循环肿瘤细胞团(circulating tumor microemboli, CTM)，肿瘤细胞在进入外周循环的过程中会发生上皮-间质转变(epithelia mesenchymal transition, EMT)，故CTCs存在不同类型，包括上皮细胞表型、间质细胞表型和上皮细胞与间质细胞混合表型。CTM和间质细胞表型CTCs具有更强的转移潜能。肿瘤的复发转移与CTCs密切相关，监测CTCs可早于常规影像学检查手段发现肿瘤和预估肿瘤复发的风险。肺癌EMT型中的CTCs与复发的肿瘤干细胞有关。有学者研究发现，NSCLC患者术前较高的CTCs计数与预后相关[64]。

三、展望

随着近年来蛋白质组学(proteomics)，基因组学(genomics)，免疫学(immunology)，分子生物学(molecular biology)，化学(chemistry)以及单细胞(single-cell)操作技术的研究深入，促进了生物标志的识别、检测与确认，也加深了临床医师对于肺癌的认识。尽管学者们已经开发和研究了用于临床的多种生物标志物，但是对肺癌的诊断依然困难，特别是早期的诊断，使得肺癌的治疗更具复杂性[65]。肺癌仍然是所有癌症中病死率最高的恶性肿瘤。对于肺癌尽管已经进行了大量的基础研究和临床观察，但是目前所得到公认的肺癌血清生物标志物敏感性、特异性与重复性均较低，尤其是单一生物标志物检测肺癌仍然十分困难。就既往研究肺癌生物标志物的临床经验而言，发现许多在血清和/或血浆中显示蛋白质/缩氨酸生物标志物在检测范围上似乎也涵盖了其他一些疾病，特别是其他脏器的癌症和炎症。因此凾需寻找真正的与肺组织相关特异性的肿瘤生物标志物，首先需要找到肺组织特异性基因与蛋白质。因肺癌的种类很多，不同的肺癌种类形态异质性反映在分子水平上。为了发现敏感性与特异性高的肺癌生物标志物，多生物标志物联用不仅能够将多种有特定分子类型的生物标志物相结合，而且还能将不同的分子类型相结合，比如蛋白质和mRNA、DNAm、循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTCs)的结合。EGFR突变引起的细胞增殖，导致肿瘤生物学的改变和肿瘤代谢变化[66]。临床上联合应用血清或其他体液中的多种肿瘤生物标志物可供简单、方便、高效、无创的检测手段，并能降低肺癌患者的病死率。但是到目前为止肺癌肿瘤生物标志物的发现、确认与临床应用之间还存在差一定的差距，其原因是肿瘤生物标志物实验研究结果显示的敏感性、特异性与重复性尚较低。因此，随着越来越多的肺癌生物标志物的发现，以及其他更多肺癌标志物的开发。相信敏感性、特异性和重复性高的肺癌生物标志物在不久的将来定会研发出来，造福于肺癌患者。

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(本文编辑：黄红稷)

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DOI：10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2016.03.027

基金项目：国家自然科学基金资助项目(81071933)

通讯作者：金发光，Email：jinfag@fmmu.edu.cn

中图法分类号：R734.2

文献标识码：A

(收稿日期：2016-04-25)

七营2011级1

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