木瓜蛋白酶对丝素的作用

师体海, 邓一民

(西南大学 纺织服装学院, 重庆 400715)



木瓜蛋白酶对丝素的作用

师体海, 邓一民

(西南大学 纺织服装学院, 重庆 400715)

摘要:首先用Na2CO3反复脱胶将蚕丝丝胶全部去除,再用木瓜蛋白酶直接对脱胶后的丝素进行处理,以此研究木瓜蛋白酶对丝素的作用。进一步测试木瓜蛋白酶处理前后蚕丝断裂强度,并进行扫描电镜观察和X射线衍射表征。实验结果表明,木瓜蛋白酶对丝素的水解率很小,处理后丝素断裂强力下降,表面微观形貌有较大的损伤,酶处理不会改变丝素晶型,但破坏了丝素结晶结构,使结晶度下降。丝素强力损失随处理时间延长、酶浓度增加而增大,随温度升高先增大后减小。

关键词:木瓜蛋白酶; 丝素; 质量损失; 强力损失; 形态结构

随着生物工程新技术在中国迅速发展,酶的制造与应用领域不断扩大,酶在纺织工业中的应用逐渐成熟[1]。蛋白酶用于蚕丝脱胶的研究很多,较传统的高温碱法脱胶、蛋白酶脱胶不损伤丝素,并且具有脱胶均匀,光泽和手感好,能降低能源和助剂的消耗,降低生产成本的优点[2-3]。因此,酶在蚕丝整理脱胶的应用引起了较多的关注,木瓜蛋白酶在蚕丝脱胶中的应用已有初步研究。由于蛋白酶具有反应专一性,酶用于蚕丝处理的对蚕丝损伤很小,有研究人员认为木瓜蛋白酶只能对丝胶中的球蛋白起作用,而不会对丝素中的线性蛋白造成影响[4-6],但木瓜蛋白酶是否对丝素造成损伤没有明确的研究结果。酶还可用于蚕丝的整理,目前已有这方面的研究,如MTG酶用于真丝织物的抗皱整理[7],漆酶和酪氨酸酶用于提高真丝织物抗菌性、抗皱性[8],都获得较好的效果。本文从力学性能和丝素微观结构方面调查木瓜蛋白酶对丝素的作用,并对不同处理条件下木瓜蛋白酶对丝素的作用大小进行研究。同时,研究木瓜蛋白酶对丝素表面形态和结晶结构的影响,为木瓜蛋白酶用于蚕丝整理提供依据。

1　实　验

1.1材料与仪器

材料：家蚕生丝(重庆金凤丝绸有限公司),木瓜蛋白酶(活性≥50 万U/g,北京奥博星生物技术责任有限公司),无水碳酸钠(AR,成都市科龙化工试剂厂),氨水(AR,成都市科龙化工试剂厂),盐酸(AR,成都市科龙化工试剂厂),氢氧化钠(AR,成都市科龙化工试剂厂),苦味酸(AR,台山市众城化工有限公司),胭脂红(AR,台山市众城化工有限公司)。

仪器：LLY-06电子单纤维强力仪(莱州市电子仪器有限公司),JA2003N电子天平(上海精天电子仪器厂),SHA-C恒温振荡器(国华企业),DHG-9245A电热恒温鼓风干燥箱(上海齐欣科学仪器有限公司),飞纳PhenomTH全自动扫描电子显微镜(飞纳中国上海复纳科学仪器有限公司),DX-2000型X衍射仪(丹东方园仪器有限公司)。

1.2方法

1.2.1丝素制备

将生丝放入0.5 g/L Na2CO3溶液中煮沸30 min,用70 ℃水洗2次,重复以上过程3次,之后在烘箱中105 ℃烘干至恒重(重复烘干,称量3次,3次质量差值小于0.5%视为恒质量)[9]。经苦味酸胭脂红试剂检验并保存待用。

1.2.2脱胶程度鉴定

采用苦味酸胭脂红鉴别脱胶程度。苦味酸胭脂红溶液：将1 g胭脂红加入25%氨水10 mL和20 mL蒸馏水搅拌加溶解,加15 mL饱和苦味酸后,用水定容至100 mL,再用HCl调pH值至8.0～9.0[4]。鉴别流程：样品+检验液(浸没样品)→沸水浴5 min→蒸馏水洗涤→观察(丝胶红、丝素黄)。

1.2.3木瓜蛋白酶处理

木瓜蛋白酶对丝素的处理：将脱胶后的丝素直接浸没在3 g/L的木瓜蛋白酶溶液中,然后放入恒温震荡器中处理,处理条件为浴比1︰100、温度70 ℃、时间60 min,pH=7[10]。处理后用70 ℃水洗两次,冷水水洗2次再放入恒温烘箱中(105 ℃)烘干至恒重。为研究不同处理条件对酶作用的影响,分别改变处理时间、温度、浓度处理条件。保持其他条件不变,酶质量浓度设置为1、2、3、4、5 g/L,温度设置为30、40、50、60、70、80 ℃,时间设置为30、60、90、120、150、180 min[11]。

1.2.4质量损失率测定

将酶处理前后的丝素放入恒温干燥箱中烘干至恒重,取3次测量平均值为酶处理前后的丝素干质量,由下式计算出丝素质量损失率。

(1)

式中：W0为酶处理前干重,W1为酶处理后干重。

1.2.5断裂强力测定

采用LLY-06电子单纤维强力仪测定试样的断裂强力,每种试样测10次取平均值,强力损失率由下式计算。

(2)

式中：bf0为酶处理前丝素的断裂强力；bf1为酶处理后的断裂强力。

1.2.6扫描电镜观察

采用全自动扫描电子显微镜对丝素纤维表面形态进行观察,加速电压15 kV,试样直接放置于扫描电子显微镜置物台上,抽真空后即可开始观察。

1.2.7X衍射测定

采用丹东方园仪器有限公司的DX-2000型X衍射仪,将所测样品剪成粉末状,在X射线粉末衍射仪(Cu靶,管压36 kV,管流50 mA,λ=1.5406)上测试,角度衍射扫描范围为5°～50°,扫描步长为0.02°/s,扫描速度为2°/min。

2　结果与讨论

2.1木瓜蛋白酶处理对丝素形态结构的影响

丝素经3 g/L木瓜蛋白酶处理后(浴比1︰100,温度70 ℃,时间60 min,pH=7),丝素质量损失2.13%,强力损失62.24%。在相同条件下,与之对照的水对丝素的作用较小,质量损失1.71%,强力损失13.1%,由此可知木瓜蛋白酶对丝素有较大的损伤作用。木瓜蛋白酶对丝素的溶解能力较小[12],但对强力的损害较大。

为进一步从微观上观察木瓜蛋白酶对丝素的作用,本文对木瓜蛋白酶处理前后的丝素进行了扫描电镜观察,扫描电镜如图1所示。丝素在酶处理前后表面形貌显示了巨大的差异,进一步证实酶对蚕丝丝素有很大的损伤作用。生丝用Na2CO3脱胶后,表面光滑细腻；再经酶处理之后,表面变得粗糙、凹凸不平,在酶的作用下丝素部分溶解,成块状的脱落,形成沟槽,部分地方沟槽较深,证明酶对丝素表面具有较大的侵蚀作用。酶对丝素表面形貌的损伤造成表面缺陷,推测这是丝素力学性能下降的一个原因。

图1　处理前后丝素电子扫描图像Fig.1　SEM image of untreated and treated fibroin

为了分析木瓜蛋白酶对丝素内部结构的影响,对酶处理前后丝素纤维进行了X射线衍射(XRD)表征,酶处理前后的丝素X射线衍射图如图2所示。图2中，衍射主峰位置分别在20.58°和20.04°,强度分别为257.21和123.93,酶处理前后衍射主峰位置大致不变,但衍射峰的强度下降,表明酶处理不会改变丝素纤维晶型,丝素结晶区主要是β折叠结构[14]。而酶处理后蚕丝纤维结晶度有降低,说明酶的水解作用已经侵入到丝素蛋白结晶区,破坏了结晶结构,使结构趋于无规则化。纤维结晶结构的破坏,结晶度的下降都会造成力学性能的下降,推测这是造成蚕丝力学性能下降的另一个原因。另外,木瓜蛋白酶处理后,丝素表面结晶度降低,出现大量缺陷,增大了丝素表面面积,两者都将增大丝素反应性能。综上,酶可以用于清洁丝织物改性[7]和前处理[8]。

图2　处理前后丝素的X射线衍射图Fig.2　XRD curves of untreated and treated fibroin

2.2木瓜蛋白酶处理条件对丝素的影响

2.2.1木瓜蛋白酶质量浓度的影响

当酶质量浓度为1、2、3、4、5 g/L,浴比为1︰100,温度70 ℃,处理时间60 min时,试样的强力损失率和质量损失率如图3所示。图3显示,丝素质量损失率很小,最大为2.13%,随着酶质量浓度的增加丝素质量损失量没有明显的变化规律,说明酶质量浓度的变化对丝素溶解量影响不大。丝素的强力损失随着酶质量浓度的增加呈明显的上升趋势,随着酶质量浓度的增加丝素强力迅速降低,用1 g/L木瓜蛋白酶处理后其强力降低了45.3%,当质量浓度升高至5 g/L强力降低73.11%。在加热条件下水对丝素的作用较小,强力损失13.1%。综上,木瓜蛋白酶对丝素有很大的损伤作用,并且随酶质量浓度的增加而增加。

图3　木瓜蛋白酶质量浓度对丝素的影响Fig.3　The effect of papain’s mass concentration on fibroin

2.2.2木瓜蛋白酶处理时间的影响

当处理时间分别为30、60、90、120、150、180 min,酶质量浓度为3 g/L,温度为70 ℃,浴比为1︰100时,处理结果如图4所示。图4显示,丝素质量损失率很小,最大1.74%,可以看出酶处理时间对丝素质量损失率没有明显的影响。丝素的强力随着酶处理时间的延长呈下降趋势,处理30 min丝素强力损失率为48.07%,延长时间至60 min时丝素强力损失率为69.34%,再延长时间丝素强力损失较慢,处理3 h时强力损失率为79.76%。综上,木瓜蛋白酶对丝素的损伤随处理时间的延长而增大。

图4　木瓜蛋白酶处理时间对丝素的影响Fig.4　The effect of papain treating time on fibroin

2.2.3木瓜蛋白酶处理温度的影响

当处理温度分别为30、40、50、60、70、80 ℃,浴比为1︰100,酶质量浓度为3 g/L,处理时间为60 min时,处理结果如图5所示。图5显示,随着温度升高,丝素的质量损失率先升高后减小,温度太高与温度太低丝素的质量损失率都很小。丝素的强力损失率也是先增大后减小,当处理温度为30 ℃时,丝素强力损失率40.83%,温度上升到70 ℃时,强力损失率62.03%,温度继续升高至80 ℃,强力损失率减小为56.04%,这是由于在较低温度下酶的活性较低,对丝素的作用较小,而温度超过70 ℃,酶遭到破坏活性降低。木瓜蛋白酶对丝素的损伤随温度的升高先增大后减小。

图5　木瓜蛋白酶处理温度对丝素的影响Fig.5　The effect of papain treating temperature on fibroin

3　结　论

1)木瓜蛋白酶处理对丝素的溶解较小,但是对丝素强力的损失影响较大。

2)木瓜蛋白酶处理对丝素表面形态有很大的损伤,酶处理后丝素结晶类型没有改变,但丝素的结晶度略有下降。由此推测木瓜蛋白酶对丝素表面形貌的损伤和结晶结构的破坏共同造成了丝素强力的损失。

3)随着木瓜蛋白酶处理时间的延长,质量浓度的增加,木瓜蛋白酶对丝素的损伤增大,随着处理温度的增加丝素损伤先增大后减小。酶处理时间、酶浓度、处理温度控制在较低范围时,损伤较小。

参考文献：

[1]陈芳,穆虹.木瓜蛋白酶在蚕茧脱胶上的初步应用[J].广东蚕业,1996,30(4):53-56.

CHEN Fang, MU Hong.Primary application of papain in silk degumming[J].Guangdong Sericulture, 1996, 30(4):53-56.

[2]MAHMOODI N M, ARAMI M, MAZAHERI F, et al.Degradation of sericin (degumming) of persian silk by ultrasound and enzymes as a cleaner and environmentally friendly process[J].Journal of Cleaner Production, 2010(18):146-151.

[3]蒋少军,吴红玲.蚕丝的酶处理[J].四川丝绸,2002(4):22-25.

JIANG Shaojun, WU Hongling.Enzyme treatment of silk[J].Sichuan Silk, 2002(4):22-25.

[4]高香芬,左保齐.不同脱胶方法对蚕丝机械性能的影响[J].丝绸,2008(4):30-33.

GAO Xiangfen, ZUO Baoqi.Influence of different degumming method on silk mechanical property[J].Journal of Silk, 2008(4):30-33.

[5]周小进,董雪.不同脱胶方法对蚕丝性能的影响[J].针织工业,2013(4):44-48.

ZHOU Xiaojing, DONG Xue.An analysis on the influence of different degumming methods on silk properties[J].Knitting Industries, 2013(4):44-48.

[6]谢峥,唐昱.丝绸染整技术的最新进展[J].印染,2010(21):48-49.

XIE Zheng, TANG Yu.Latest progress of silk dying technology[J].Dyeing & Finishing, 2010(21):48-49.

[7]田晓蕊.MTG酶对真丝织物的抗皱整理[D].无锡:江南大学,2007.

TIAN Xiaorui.Improving Crease-Resistance of Silk Fabric with Microbial Transglutaminase(MTG) Treatment[D].Wuxi:Jiangnan University, 2007.

[8]郭守娇.基于生物酶的真丝功能改性[D].苏州:苏州大学,2013.

GUO Shoujiao.The Modification of Silk Based on Biological Enzyme[D].Suzhou:Soochow University, 2013.

[9]张显华,左保齐.桑蚕丝脱胶实验研究[J].丝绸,2008(10):33-34.

ZHANG Xianhua, ZUO Baoqi.Study on degumming of silkworm silk[J].Journal of Silk, 2008(10):33-34.

[10]邓一民,张高军,敬凌霄,等.蚕丝木瓜蛋白酶脱胶工艺条件探讨[J].丝绸,2009(3):20-28.DENG Yimin, ZHANG Gaojun, JING Lingxiao, et al.Investigating the process conditions of Mulberry silk degumming with Papain[J].Journal of Silk, 2009(3):20-28.

[11]李清兵,陈智毅,吴娱明.丝素的酶解[J].广东蚕业,2000,30(4):43-46.

LI Qingbing, CHEN Zhiyi, WU Yuming.Enzymatic hydrolysis of silk[J].Guangdong Sericulture, 2000, 30(4):43-46.

[12]吴焕岭.蚕丝织物蛋白酶脱胶工艺[J].印染,2013(16):20-22.

WU Huanling.Degumming of silk fabric with protease[J].Dyeing & Finishing, 2013(16):20-22.

[13]马玲,傅吉全.热处理对桑蚕丝结构和性能的影响[J].北京服装学院学报,2012,32(2):35-40.MA Ling, FU Jiquan.Influence of heat treatment on mulberry silk structure and performance[J].Journal of Beijing Institute of Clothing Technology, 2012, 32(2):35-40.

[14]李欢欢,傅吉全.应用红外光谱技术分析蚕丝织物酸水解老化过程的结构变化及对强度的影响[J].蚕业科学,2013,39(1):100-105.

LI Huanhuan, FU Jiquan.An infrared spectrometric analysis on structural change of aging silk fabric from acid hydrolysis and its impact on silk strength[J].Science of Sericulture, 2013, 39(1):100-105.

DOI:10.3969/j.issn.1001-7003.2016.03.005

收稿日期:2015-07-30; 修回日期:2016-01-13

基金项目:国家高技术发展计划(863)课题资助项目(2013AAI02507)；国家茧丝绸生态产业技术平台资助项目(07021441 CITC5Y10)

作者简介:师体海(1991),男,硕士研究生,研究方向为纺织品整理及生物整理。通信作者：邓一民,副教授,496689548@qq.com。

中图分类号:TS143.321

文献标志码:A

文章编号:1001-7003(2016)03-0027-05引用页码:031105

The effect of papain treatment on fibroin

SHI Tihai, DENG Yimin

(College of Textile and Clothing, Southwest University, Chongqing 400715, China)

Abstract:In this paper, silk sericin was degummed repeatedly with Na2CO3.Then, papain was used to treat degummed fibroin so as to study the effect of papain on fibroin.The breaking strength before and after papain treatment was further tested.Meanwhile, SEM observation and X ray diffraction characterization were conducted.The experimental result shows that the hydrolysis rate of fibroin is small, but the breaking strength of fibroin declines and the microscopic surface damages greatly.Papain treatment will not change crystal form of fibroin, but destroys crystalline structure of fibroin.Besides, the degree of crystallinity declines.The strength loss of fibroin rises as treatment time extends and enzyme concentration increases, but it first increases and then decreases with the rise in the temperature.

Key words:papain; fibroin; mass loss; strength loss; morphological structure