丝素作为固定化酶载体材料的研究进展

潘彩霞，杨明英，朱良均

（浙江大学应用生物资源研究所，浙江杭州 310058）

丝素作为固定化酶载体材料的研究进展

潘彩霞，杨明英，朱良均

（浙江大学应用生物资源研究所，浙江杭州 310058）

酶的固定化在化学、生物医学以及生物感应器等领域应用较广。固定化酶的效果在很大程度上取决于载体结构。丝素作为固定化酶载体材料有其独特的优势。本文综述了国内外以不同的丝素形态作为固定化酶载体材料的研究进展，重点介绍了非纳米丝素固定化酶和纳米丝素固定化酶（丝素纳米颗粒和丝素纳米纤维）的研究进展。

丝素；固定化酶；纳米固定化酶

酶是活细胞所分泌的具有催化功能的蛋白质是生物催化剂，生物体各种生化反应除极个别外，绝大多数由酶催化。酶的种类多，应用范围广，如在有机化学和制药工业、生物医学、食品生产、分析化学与临床诊断、三废处理等领域都有大量的应用与研究。

多数酶是水溶性的，但溶液酶的应用仍然存在着不少缺点，如反应后酶和产物、底物不易分离；酶不能重复使用，使用效率低成本高；稳定性差；酶反应过程不易控制等［1］。酶固定化的出现为解决这一问题提供了重要支撑。固定化酶是利用化学、物理或生物方法，将目标酶在保持活性的前提下构筑于特定载体上而发挥生物催化作用［2］。固定化酶具有稳定性好、可重复利用和易分离等优点，是一种低耗高效且易于自动化的酶催化反应工具，在蛋白质酶解、生物转化以及生物传感器等方面具有独特优势。

但大多数酶固定以后，其活力通常低于相同的溶液酶，其原因除了酶种类及反应性有关外，同时也与固定的载体条件和方法有关：其中载体的亲水、疏水性质和介质的介电常数等直接影响酶的催化效率或者酶对底物做出的反应能力，因此载体材料的好坏直接影响固定化酶的性质和应用范围。

丝素有大量的亲水和疏水基团，不需要任何的交联剂，就能完成基本的固定，因此固定过程中很少引入其他的化学试剂，从而减小酶失活的可能性，提高了酶的固定效率；丝素作为固定化酶载体，固定强度强，热稳定性好，丝素蛋白变性的程度可控，减少固定化酶使用时的酶的渗出；丝素无毒，安全性高，应用在医学上有其他材料无法比拟的优势；丝素的可塑性高，经过一定的处理可以制成多种形状，如薄膜、粉末、海绵、凝胶、纳米颗粒、纳米纤维等。这些独特的性能，使得丝素成为固定化酶的优质材料［3］。近年来，也有不少以丝素作为固定化酶载体的研究，并取得了一定的成果。

1 非纳米丝素固定化酶

丝素被关注并作为固定化酶载体已有几十年的研究过程。早期的丝素作为固定化酶载体的主要是以非纳米的形式。非纳米丝素的形式和状态多样，和酶结合制成固定化酶的包括丝素纤维［4］，丝素膜［5］，丝素粉末［6］，丝素海绵等。

朱祥瑞等［7，8］将脱胶蚕丝用稀碱溶液处理后制成多孔的碱化丝素，经物理吸附方法分别固定α-淀粉酶和葡萄糖异构酶，制得碱化丝素固定化酶。同时，将蚕丝脱胶溶解、脱盐等处理后制成丝素粉末，经吸附后用戊二醛为交联剂分别固定α-淀粉酶和葡萄糖异构酶，制成粉末丝素固定化酶。经对固定化酶性质的研究表明：碱化丝素纤维和丝素粉末均能较好的固定α-淀粉酶和葡萄糖异构酶，最适温度比游离酶升高了10～15℃，具有较长的操作半衰期和贮存稳定性。

Lu等［9］向丝素溶液中分别加入葡萄糖氧化酶、脂肪酶和辣根过氧化物酶，配成一定比例的混合溶液，放在培养皿中自然风干制成固定了酶的丝素膜，并测定了这三种固定化酶的活性和稳定性。除此之外，还将制成的固定化酶膜浸入甲醇中使该固定化酶成为不溶水的膜，并与未经甲醇处理的固定化酶膜进行稳定性和活性的比较分析。结果显示，保存在37℃10个月的丝素固定化葡萄糖氧化酶的活性基本没有减弱，相比经甲醇处理的，未经甲醇处理的固定化酶的稳定性更高；相比于未经丝素固定的辣根过氧化物酶和葡萄糖氧化酶，经丝素固定的酶都显示出显著的活力稳定性。实验表明，丝素膜是长期固定、贮存酶的有效载体。

虽然丝素膜是很好的固定材料，但是未经处理的丝素膜易溶于水，酶的溶失率较高，而经甲醇处理的丝素膜的固定化酶的活性和稳定性受到一定的影响。王亚玲等［10］将丝素与硅酸甲酯（TMOS）作用，从而获得SF/SiO2杂化膜，该杂化膜的溶失率明显小于丝素膜。然后再将粗马铃薯多酚氧化酶固定于SF/ SiO2杂化膜上，从而得到丝素/SiO2杂化膜固定化多酚氧化酶，并用于处理模拟含酚废水。SF/SiO2杂化膜在水中的溶失率小于丝素膜在水中的溶失率。所得SF/SiO2杂化膜固定化多酚氧化酶的最适宜pH为7.4。相对于游离多酚氧化酶，该酶具有较好的稳定性，贮存稳定性及重复使用性。研究表明，SF/SiO2杂化膜固定化多酚氧化酶有实际处理含酚废水的可能。

稳定的3D蛋白质梯度在组织再生过程中非常的重要。所以制备3D的固定化酶将扩大固定化酶的使用范围，也是固定化酶形态的发展趋势。Vepari等［11］将丝素溶液和氯化钠以一定比例混合，并将该溶液蒸发，经甲醇处理，制备成3D的丝素多孔支架。以碳化二亚胺将辣根过氧化物酶固定在3D的丝素支架上，制成3D丝素支架固定化酶。固定后的酶对时间和温度的稳定性较以直接吸收的方式固定的酶都有所增强。

2 纳米丝素固定化酶

现代酶技术，作为工业生物技术科学的一个分支，正广泛探索如何极大限度的使酶在细胞外长期保持活性，并能有效适应非生态环境的条件。纳米科学的迅速发展为酶的稳定和高效催化带来了新的机遇。纳米材料作为酶固定化的新型载体，能体现良好的生物相容性、较小的颗粒直径、较大的比表面积、较小的扩散限制、有效提高载酶量并能在溶液中稳定存在等优点［12］。近年来，以纳米丝素作为固定化酶载体主要有丝素纳米颗粒和静电纺丝丝素纳米纤维两种形式。

2.1 丝素纳米颗粒固定化酶

张雨青等［13］将脱胶的丝素在不同的环境条件下溶解，可以获得分子量分布不同的液态丝素，并用有机溶剂将这种水溶液丝素制备成丝素纳米颗粒。以这些丝素纳米颗粒为载体，用戊二醛为交联剂制成丝素纳米颗粒-L–天冬酰胺酶结合物。研究表明，分子链断裂较少的液态丝素制成的纳米颗粒更适合酶的固定化。结果显示，L-天冬酰胺酶与丝素纳米颗粒经戊二醛交联后，其热稳定性较游离的酶有明显的提高，最适反应温度提高10℃，且范围有所加宽，最适pH范围为6.0～8.0。

周珍祯等［14］以丝素纳米颗粒为载体，分别以交联和包埋两种方式，制备β-葡萄糖苷酶-丝素纳米颗粒结合酶。以游离酶为对照，利用对硝基苯基-β-D-葡萄糖苷为底物，探讨了两种结合酶制备的最佳实验条件并分析了两种结合酶的活性等性能。结果表明，以戊二醛为交联剂制备的β-葡萄糖苷酶-丝素纳米颗粒在戊二醛浓度为0.25%、交联时间5 h、交联温度37℃以及酶（U）与丝素纳米颗粒（mg）比例为75∶100条件下可以获得最佳生物连接效果；用包埋法制备的β-葡萄糖苷酶-丝素纳米颗粒在酶（U）与丝素蛋白（mg）比例为1∶1条件下可获得最佳固定效果；两种方法所得的结合酶活性回收率分别为46.0%和59.2%。结果还显示，无论是包埋还是交联，游离酶和丝素纳米颗粒结合后，热稳定性都有所提高，也都具有良好的操作稳定性，可以反复使用。

Ai等［15］将丝素和聚酰胺-胺共价结合到磁性Fe3O4纳米颗粒上，制备成磁性丝素纳米颗粒，并用戊二醛将辣根过氧化物酶（HRP）交联到磁性丝素纳米颗粒上制备成结合酶。向反应溶液中插入电极，在溶液中直接产生过氧化氢，同时通入氧气。该方法不仅将丝素制备成纳米颗粒增加了酶载量和反应的比表面积；加入的Fe3O4方便反应结束后固定化酶的回收；同时该装置还自助制H2O2，免去了随时要加H2O2的麻烦。结果显示，制备的磁性丝素纳米颗粒载酶量达0.7 mg/g。酶的活力回收达68%，固定化辣根过氧化物酶的活力达476 U/g纳米颗粒。该研究还为用电极和酶结合的方法除去废水中的有机磷和芳香类化合物提供了理论依据。

2.2 静电纺丝丝素纳米纤维固定化酶

静电纺丝是近年来制备纳米纤维的一项新兴技术，是在高压电场的作用下的一种纺丝过程［16］。静电纺丝技术的操作方法简单、制备成本低廉，采用该技术制备的纳米纤维已被广泛应用于滤器、复合材料及传感器、生物医药等领域［17］。因为静电纺丝纳米纤维具有结构丰富、持久耐用、比表面积大以及易于分离回收等优点，许多学者将其用于酶的固定化研究。将电纺纳米纤维膜作为固定化酶的载体，有利于酶与底物充分接触，能有效提高酶的催化效率和重复利用性，因此被认为是一种潜在的具有广阔应用前景的酶固定化基质，并成为静电纺丝纳米纤维应用研究领域的研究热点之一［18］。

将丝素制成静电纺丝纳米纤维膜用来固定酶，将充分发挥静电纺丝和丝素在酶固定化领域的优势。Hwan Park等［19］将丝素溶液静电纺丝成直径不同的纳米纤维，固定胰凝乳蛋白酶。结果显示，丝素纳米纤维能达到5.6 wt%的载酶量；直径为20 5nm的丝素纳米纤维固定化酶在25℃环境下24 h的酶活力回收值仍达90%；320 nm的丝素纳米纤维固定化酶经乙醇处理仍显示出较强稳定性，活力回收值仍高于45%。研究结果表明，丝素纳米纤维固定化酶的活力强于丝素纤维固定化酶的活力。

3 结语

丝素作为固定化酶载体材料有其独特的优势。随着纳米材料的普及和应用，纳米丝素固定化酶将成为丝素固定化酶的研究热点，尤其是静电纺丝纳米丝素，制备成本低、操作简便、固定效果好，将是今后值得关注的课题。虽然至今已有很多关于丝素作为载酶载体的研究，但应用在实际生产中仍具有一定的限制。丝素作为固定化酶的载体材料仍需继续探索和改进。

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Research on Progress of Fibroin as Immobilized Enzyme Carrier Materials

PAN Cai-xia,YANG Ming-ying,ZHU Liang-jun

（Institute of Applied Bioresources,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China）

Immobilized enzyme has been applied in many fields such as chemical biomedical and biological sensors. The effect of the immobilized enzyme depends largely on the structure of the supporter.Researches in the recent years show that silk fibroin as immobilized enzyme supporter material has its unique advantages.This article reviews the do⁃mestic and foreign scholars in different fibroin forms as the research progress of immobilized enzyme carrier materials, including the silk fibroin immobilized enzyme and nano silk fibroin immobilized enzyme(nanoparticles and nanofibers).

silk fibroin;immobilized enzyme;nano-immobilized enzyme

S886.9

A

0258-4069［2014］03-009-04

现代农业产业技术体系专项（CARS-22）

潘彩霞（1992-），女，江西景德镇人，硕士研究生。从事蚕丝蛋白生物资源高分子材料研究。E-mail:412932303@qq.com

朱良均，教授，博士生导师。E-mail:ljzhu@zju.edu.cn