酶解法提取白鲢鱼油的工艺研究及品质分析

骆 婷， 许学勤， 夏文水， 姜启兴， 许艳顺

(江南大学食品学院，江苏无锡 214122)



酶解法提取白鲢鱼油的工艺研究及品质分析

骆 婷， 许学勤， 夏文水， 姜启兴， 许艳顺

(江南大学食品学院，江苏无锡 214122)

[目的]为淡水鱼加工副产物的综合利用及淡水鱼油的提取提供方法和依据。[方法]采用酶解法对白鲢腹部进行鱼油提取，研究酶的种类、液固比、酶解温度、pH和酶用量等因素对鱼油提取率的影响，并对得到的粗鱼油进行理化性质和脂肪酸组成分析。[结果]试验表明，碱性蛋白酶对腹部鱼油的提取效果最好，在液固比1.0∶1mL/g的条件下进行响应面优化得到最佳的工艺参数为：酶解温度54 ℃，加酶量8 200U/g，pH8.6，此条件下酶解3h得到鱼油提取率为64.32%，鱼油过氧化值为5.48mmol/kg，碘价为1 204.20g/kg，皂化价为169.21mg/g，酸价为3.56mg/g，其中二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)的含量分别为6.54%和4.53%，n-3/n-6值为2.89。[结论]所得鱼油的各项指标符合1级粗鱼油标准，营养价值较高，应用前景广阔。

鱼油；酶解；提取；脂肪酸组成

作为全球淡水鱼生产消费大国，我国的淡水渔业一直处于持续增长阶段。根据中国渔业统计年鉴，2015年我国淡水养殖产量为2 935.76万t，占淡水产品产量的92.74%[1]。现有的淡水鱼深加工主要集中于鱼糜及鱼糜产品的加工，其综合利用率只有30%～50%，要提高淡水渔业的综合产值、降低淡水鱼制品的成本，就要对其加工下脚料进行充分的加工与利用[2]。

目前淡水鱼加工下脚料主要用于低值鱼粉的加工，并产生鱼油等加工副产物，这两者主要用于制作饲料和饲料添加物，鱼油的综合产量低且品质较差、附加产值低。与海水鱼相比，淡水鱼油的应用和研究较少，主要是因为淡水鱼鱼体组织中的鱼油含量较低。根据GuipuLi等的研究，在对29种淡水鱼、海水鱼以及虾的脂肪含量和脂肪酸组成进行比较发现，大多数淡水鱼的n-3/n-6值要小于1，n-3多不饱和脂肪酸含量低于n-6，但还有一些大宗淡水鱼，例如白鲢、鳙鱼等具有接近海水鱼油的n-3/n-6值[3]。

现在研究较多的鱼油提取方法有蒸煮压榨法、溶剂提取法、水酶法以及淡碱水解法等。研究工艺改进的主要目的在于提高提取率、减少加工过程中杂质对环境的污染[4]。采用添加外源酶的方法分解蛋白获得鱼油的方法称为酶解法。酶解法一般采用商业经济的食品级蛋白酶，是一种十分具有发展前景的提取方法，也是现在研究最为广泛的提取方法之一。与其他提取方法相比，酶解法在提取效率以及能源重复利用率方面都具有一定的优势。笔者选择大宗淡水鱼之一的白鲢作为试验原料，研究不同酶解条件对白鲢腹部鱼油提取率以及相关品质的影响，并对所得鱼油进行性质分析和脂肪酸组成分析，为开发高价值的鱼油产品提供参考。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1原料及主要试剂。原料：白鲢，购于华润万家超市(2.5～3.0kg),选用部位为腹部。主要试剂：乙醇、氯仿、碘化钾、淀粉、冰醋酸、氢氧化钾等，国药集团化学试剂有限公司，试剂均为分析纯；碱性蛋白酶，诺维信生物技术有限公司；胰蛋白酶、风味蛋白酶、胃蛋白酶，国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2主要仪器设备。JB5374-91电子天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；GC-2010气相色谱仪，日本岛津公司；UV1000紫外-可见分光光度计，上海天美科学仪器有限公司；UltraScanPro1166高精度分光测色仪，美国Hunterlab公司。

1.2方法

1.2.1原料预处理工艺。取新鲜的白鲢腹部，清洗干净、去膜、打碎，冷冻备用。

1.2.2酶解法鱼油提取工艺。取冷冻的鱼腹部下脚料，于4 ℃条件下低温解冻，按照一定的液固比加入蒸馏水进行打浆。将其水浴加热到规定反应温度后，添加稀盐酸或稀氢氧化钠调整pH，加入一定量的酶，并在反应温度下进行酶解。到规定时间后，在95 ℃水浴下加热10min进行灭酶，冷却后在5 000r/min条件下离心20min，分离上层清油以及中层乳化层，将乳化层按照1∶3的比例加入正己烷并在35 ℃条件下静置分层，将分离得到的有机相进行旋转蒸发得到鱼油，合并两部分鱼油，进行提取率的计算以及相关品质分析。

1.2.3提取率计算。鱼油提取率按式(1)计算：

(1)

式中,R为鱼油提取率(%)；m1为所得鱼油质量(g)；m2为原料中鱼油的质量(g)。

1.2.4理化指标的测定。皂化价测定：按GB/T5534—1998执行；过氧化值测定：按GB5538—2005执行；酸价测定：按GB/T5530—2005执行；碘价测定：按GB/T5532—1995执行。

1.2.5脂肪酸组成分析。采用气相色谱法测定。样品前处理：取适量油脂样品于离心管中，加入2mL0.5mol/L的NaOH-甲醇溶液，置于60 ℃水浴加热40min，冷却后加入2mL25%BF3-甲醇溶液，继续放入60 ℃水浴中进行酯化反应30min，冷却后加入2mL正已烷振荡，最后加入饱和NaCl2mL溶液振荡，离心取上层有机相于离心管中进行脂肪酸组成分析。分析条件参照文献[5]。

2　结果与分析

2.1蛋白酶种类对鱼油提取率的影响在液固比为1.2∶1mL/g、酶添加量为10 000U/g的条件下，根据酶种类选择合适的酶解pH，在最适反应温度条件下反应3h，所得鱼油的提取率见表1。

表1　不同蛋白酶对酶解效果的影响

从表1可以看出，在上述条件下，对于白鲢腹部下脚料中鱼油的提取，碱性蛋白酶的提取率最高，同时碱性蛋白酶水解液中的蛋白回收率最高。从资源再利用以及经济角度考虑，选用碱性蛋白酶作为下一步的酶解试验用酶。

2.2加酶量对鱼油提取率的影响在液固比1.2∶1mL/g、温度55 ℃、pH8.5的条件下酶解3h，分别考察酶添加量4 000、6 000、8 000、10 000、12 000U/g时鱼油提取率的变化情况。从图1可以看出，随着酶添加量的增加，鱼油提取率仍然呈现先增大后减小的趋势。这是因为在底物未达到饱和的情况下，酶量的增加可以促进蛋白质的水解，当达到饱和之后，由于酶自身的水解或者抑制作用，酶解程度降低[6]，因而使油脂释放不完全，导致提取率降低。结果表明，在酶添加量为8 000U/g时，所得鱼油提取率最高。

图1　不同酶添加量对鱼油提取率的影响Fig.1　Effects of enzyme dosage on extraction rate of fish oil

2.3酶解温度对鱼油提取率的影响在液固比1.2∶1mL/g、酶添加量10 000U/g、pH8.5的条件下酶解3h，考察酶解温度45、50、55、60、65、70 ℃条件下鱼油提取率的变化情况。从图2可以看出，在酶解温度55 ℃以下时，温度的升高使得鱼油的提取率有较为明显的提升。其原因可能是因为温度升高使得酶活性得到提升，而且能够加快体系内分子的热运动，使得酶解效率提高，酶促反应更加完全。当温度超过55 ℃之后，鱼油提取率随温度的升高呈现下降的趋势。这是因为蛋白酶本身作为一种大分子蛋白质，其结构特性也会受到温度的影响，因而稳定性变差最终发生蛋白质变性，从而失去活性。此外，较高的温度也会在一定程度上加快鱼油的氧化，使鱼油颜色变深、品质变差。结果表明，较为适宜的酶解温度为55 ℃。

图2　不同酶解温度对鱼油提取率的影响Fig.2　Effects of enzymolysis temperature on extraction rate of fish oil

2.4酶解pH对鱼油提取率的影响在液固比1.2∶1mL/g、酶添加量10 000U/g、温度55 ℃的条件下酶解3h，考察pH7.0、8.0、8.5、9.0、9.5以及10.0的条件下鱼油提取率的变化情况。从图3可以看出，随着pH的增加，鱼油提取率同样呈现先增加后降低的趋势。这是由于不同的酸碱性对于底物分子和酶分子的带电性都有影响，同时酶分子的稳定性也会受到影响，因此在特定条件下，每种酶都有作用的最适pH。提取率最高时即为碱性蛋白酶在此条件下的最适pH，此时酶活性最高，酶解效果最好。结果表明，该反应的最适pH为8.5。

图3　不同pH对鱼油提取率的影响Fig.3　Effects of pH on extraction rate of fish oil

2.5液固比对鱼油提取率的影响在酶添加量10 000U/g、温度55 ℃、pH8.5的条件下酶解3h，分别考察液固比0.5∶1、0.8∶1、1.0∶1、1.2∶1、1.5∶1以及1.8∶1mL/g对鱼油提取率的影响。从图4可以看出，在一定范围内，随着体系中水添加量的增多，酶解效果增强，鱼油提取率升高。这是因为体系中的水分可以帮助蛋白酶与底物充分接触，使得酶解速度加快，酶解程度增加，同时也有利于脂肪的溶出；而超过一定含量，水分的增加就会导致提取率的降低，这可能是因为底物浓度降低、酶解反应不完全导致的。结果表明，液固比在1.0∶1mL/g的条件下，鱼油提取率最高，为61.20%。

图4　不同液固比对鱼油提取率的影响Fig.4　Effects of liquid-solid ratio on extraction rate of fish oil

2.6响应面优化试验根据上述的单因素试验结果，选择酶解温度、酶解pH以及加酶量进行3因素3水平的响应面优化试验，因素水平设计见表2。根据表2的设计进行3因素3水平的响应面优化试验，以鱼油提取率为考察指标，所得试验结果见表3。

响应面试验所得回归方程为：Y(%)=64.92-3.71X1+ 0.97X2+ 1.67X3-0.41X1X2-0.53X1X3+ 0.27X2X3-7.87X12-3.16X22-5.77X32。方差分析显示，F模型=94.59，P模型< 0.000 1**；FX1=148.74,PX1< 0.000 1**；FX2=10.24，PX2=0.015 1*；FX3=30.24，PX3=0.000 9*；FX1X2=0.89，PX1X2=0.377 4；FX1X3=1.54,PX1X3=0.255 3；FX2X3=0.38,PX2X3=0.557 0;FX12=352.83，PX12< 0.000 1**；FX22=56.94，PX22=0.000 1*；FX32=189.63，PX32< 0.000 1**；F失拟=0.52，P失拟=0.691 0。由此可见，回归方程极显著，失拟不显著，说明所得方程拟合性较好，能够较好地预测试验结果。根据F值可以看出，所测3个因素对于鱼油提取率的影响大小依次为：酶解温度、酶解pH、酶添加量。其中因素之间的交互作用影响见图5、6和7。从3D曲线以及等高线椭圆弧度来看，酶解温度对于白鲢腹部鱼油的提取率影响最大，曲线变化最为显著，在温度一定的条件下，图7中的等高线呈椭圆形，说明pH和加酶量之间的交互作用对鱼油的提取率影响较大。

表2响应面3因素3水平设计

Table2Threefactorsandthreelevelsofresponsesurfaceexperimentaldesign

水平Level因素Factor温度(X1)Temperature∥℃加酶量(X2)Enzymedosage∥U/gpH(X3)15070008.025580008.536090009.0

表3　响应面分析试验及结果

利用响应面优化得到试验范围内的最优提取条件为：酶解温度53.77 ℃，加酶量8 176.45U/g，pH8.58，理论鱼油提取率为65.59%，为方便实际操作，将上述条件修正为酶解温度54 ℃，加酶量8 200U/g，pH8.6，在此条件下进行3次平行验证试验，所得平均鱼油提取率为64.32%。

图5　温度和加酶量对鱼油提取率的影响Fig.5　Effects of temperature and enzyme dosage on extraction rate of fish oil

图6　温度和pH对鱼油提取率的影响Fig.6　Effects of temperature and pH on extraction rate of fish oil

2.7粗鱼油的理化性质分析从表4可以看出，其中所有指标均达到了国家1级粗鱼油的标准，鱼油品质较好。其中鱼油的过氧化值较高，可能与酶解时间较长发生氧化作用有关，另外还含有一些蛋白质、色素等杂质，会影响鱼油的进一步加工利用，因此还需要进行一系列精炼过程才能用于工业生产或食用。

图7　pH和加酶量对鱼油提取率的影响Fig.7　Effects of pH and enzyme dosage on extraction rate of fish oil

2.8粗鱼油的脂肪酸分析从表5可以看出，白鲢鱼油中的19种脂肪酸以长链脂肪酸为主，其中单不饱和脂肪酸的含量为43.01%，多不饱和脂肪酸的含量为28.82%，EPA和DHA的含量分别为6.54%和4.53%。n-3/n-6 高达2.89，高于文献报道的1.7[7]和2.0[8]，其中原因可能与所选原料的来源、部位以及提取方法有关。研究表明，合理的n-3/n-6多不饱和脂肪酸比例对机体健康有重要意义[9]，n-3/n-6比例较高的油脂可以起到增强免疫反应和非特异性抗性的作用，而n-3脂肪酸能够将低密度和极低密度胆固醇转化为高密度脂蛋白，从而使胆固醇从细胞内转移到肝脏中，使胆固醇被肝脏代谢[10]。该试验提取得到白鲢腹部鱼油具有较高的n-3/n-6值，是一种品质较好且具有广阔开发前景的功能性油脂。

表4　白鲢粗鱼油的理化性质

表5　白鲢粗鱼油的脂肪酸组成

3　结论

以白鲢腹部下脚料为原料，采用酶解法制备鱼油时，蛋白酶种类的选择以及酶解时的工艺条件都会对鱼油的提取率产生影响。通过试验确定，在酶解时间为3h的前提下，最优的提取条件为：液固比1.0∶1mL/g，酶解温度54 ℃，加酶量8 200U/g，pH8.6，此条件下鱼油的提取率为64.32%。各项理化指标均符合国家1级粗鱼油标准，且EPA和DHA的含量分别为6.54%和4.53%，高于白鲢鱼头鱼油[11]，n-3/n-6值为2.89，明显高于白鲢内脏鱼油的2.0[12]，这与原料来源以及采取部位有关，但表明所得鱼油的营养价格较高。此工艺过程较为简单，提取条件温和，资源回收利用率较高，所得鱼油品质较好，可作为提高淡水鱼加工附产值的有效方法。

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TechnologyResearchandQualityAnalysisofFishOilfromSilverCarpbyEnzymeHydrolysisMethod

LUOTing,XUXue-qin,XIAWen-shuietal

(CollegeofFood,JiangnanUniversity,Wuxi,Jiangsu214122)

[Objective]Toprovidemethodandreferencefortheextractionoffreshwaterfishoilandthecomprehensiveutilizationofprocessingby-productsoffreshwaterfish.[Method]Fishoilwasextractedfromthebellypartofsilvercarpbyenzymehydrolysismethod.Weresearchedtheeffectsofenzymetype,liquid-solidratio,hydrolysistemperature,pHandenzymedosageontheextractionrateoffishoil.Then,thephysicochemicalpropertyandfattyacidcompositionofobtainedcrudefishoilwereanalyzed.[Result]Alkalineproteasehadtheoptimalextractioneffectsonfishoilfrombellypart.Undertheconditionof1.0∶1liquid-solidratio,theresponsesurfaceoptimizationwascarriedout.Theoptimaltechnologywasasfollows： 54 ℃hydrolysistemperature,8 200U/genzymedosage,pH8.6and3henzymolysistime.Underthiscondition,theextractionrateoffishoilwas64.32%.Thefishoilperoxidevaluewas5.48mmol/kg;iodinevaluewas1 204.2g/kg;saponificationvaluewas169.21mg/gandacidvaluewas3.56mg/g.Amongthem,contentsofEPAandDHAwere6.54%and4.53%,respectively.Then-3/n-6was2.89.[Conclusion]Thefishoilindexesreachthefirstgradestandardofcrudefishoil,whichhashighnutritionalvalueandbroadapplicationprospect.

Fishoil;Enzymolysis;Extraction;Fattyacidcomposition

国家大宗淡水鱼产业技术体系建设专项项目(CARS-46)。

骆婷(1990- )，女，山东蓬莱人，硕士研究生，研究方向：食品加工。

2016-04-06

S986

A

0517-6611(2016)17-096-05