微泡增强的超声空化对荷瘤兔乳腺癌作用效果的研究

位红芹　余美玲　韦英丽　肖妮娜　柳建华

广州医科大学附属广州市第一人民医院超声科(广州 510180)



微泡增强的超声空化对荷瘤兔乳腺癌作用效果的研究

位红芹余美玲韦英丽肖妮娜柳建华

广州医科大学附属广州市第一人民医院超声科(广州 510180)

【摘要】目的探讨微泡增强的超声空化对荷瘤兔乳腺癌的治疗效果。方法建立兔VX2乳腺癌模型，肿瘤兔随机分成两组，超声微泡组及单纯超声组，各组于治疗前及治疗后分别行超声造影，分析造影前后肿瘤灌注情况。结果超声微泡组治疗前后造影灰阶值改变明显，造影灰阶值从治疗前的(20.26±2.59)降至(3.71±1.61)(P<0.01)；而单纯超声组肿瘤造影灰阶值无明显统计学差异(P>0.05)。结论微泡增强的超声空化对荷瘤兔乳腺癌有一定的治疗效果。

【关键词】超声空化微泡乳腺癌

微泡联合超声空化可引起生物组织结构发生明显变化，从而应用于疾病的治疗，国内外学者研究发现微泡空化能够有效阻断兔正常肝、脾血流及肠系膜微血管血流。研究发现微泡联合超声空化可致肿瘤及其周围组织中的微小血管破损，阻断肿瘤区域新生血管，抑制肿瘤生长[1]。本研究以兔VX2乳腺癌移植瘤为研究对象，采用脉冲式超声治疗仪联合静脉注射微泡方法，并用超声造影对治疗前后乳腺癌肿瘤血流灌注的改变情况进行评价。

1材料与方法

1.1实验材料①实验动物：健康新西兰白兔(雌)10只，平均体重(2.15±0.45)kg，南方医科大学实验动物中心提供。VX2荷瘤种兔购于中山大学附属肿瘤医院。②主要试剂与仪器：超声造影剂为“脂氟显”脂膜微泡由第三军医大学新桥医院超声科提供，核心气体为全氟丙烷，平均粒径2 μm，微泡浓度为(7～9)×109/mL。新型脉冲式超声空化治疗仪，发射频率1 MHz，占空比0.2%，声压3 MPa。Philipiu 22超声诊断仪，9 MHz高频探头，配有造影成像模式条件。

1.2实验方法①荷瘤兔模型建立：将荷瘤兔软组织内VX2肿瘤剪成碎片，置于生理盐水中，制备成组织块悬液。新西兰大白兔10只，每兔无菌条件下局部消毒，取1 mL组织块悬液分别注射于兔胸壁第2对乳头垫下，见局部形成隆丘后退针，定期观察肿瘤生长情况。2～3周后，肿瘤直径约为1～2 cm，高频超声可清晰显示肿瘤。这项研究已通过当地的伦理委员会的批准，所有的实验动物是根据国家卫生研究院的规定和使用的实验室动物。②实验分组：10只大白兔分为两组，超声微泡空化组及单纯微泡组，随机法每组各5只。

1.3超声造影使用Philip iu 22彩色超声诊断仪，12 L线阵探头，仪器所有条件设置为同一标准，显像深度固定，TGC、聚焦范围等参数均调至最佳状态。所有荷瘤兔均于空化治疗前、后行超声造影检查，并对造影动态图像进行时间-强度曲线分析。

1.4超声空化治疗2%戊巴比妥麻醉荷瘤兔，并建立耳缘静脉通道，超声治疗仪探头置于肿瘤处，按照预设条件治疗5 min，超声微泡治疗组治疗时缓慢推注生理盐水稀释的微泡5 mL(0.2 mL/kg)，单纯超声组以5 mL生理盐水代替微泡。

1.5病理学检查完成超声造影后处死荷瘤兔，取肿瘤组织以10%甲醛固定，常规石蜡包埋切片，行HE染色观察。

2结果

2.1VX2荷瘤兔模型建立：10只新西兰大白兔皮下移植肿瘤20d后可见椭圆形实体肿瘤，肿瘤直径1.0～2.0 cm。肿瘤生长曲线见图1。

图1　肿瘤随时间增长曲线图

2.2超声空化治疗前超声造影图像可见肿瘤血流丰富，呈高灌注状态；超声微泡组治疗后，肿瘤区域可见片状充盈缺损，部分肿瘤区域无明显造影剂灌注，造影的峰值强度明显降低(20.26±2.59，3.71±1.61，P<0.05)；单纯微泡组治疗后，肿瘤区域造影图像峰值强度无明显变化(19.27±2.67，18.79±2.64，P>0.05)。见表1、图2。

表1　治疗前后两组造影峰值强度比较

注：与治疗前比较*P<0.01，#P>0.05

2.3病理检查结果光镜下可见肿瘤组织呈实体状瘤细胞条索状排列，细胞核大深染，异型明显，肿瘤组织内血管丰富；超声微泡治疗后可见肿瘤组织出血，血管内皮细胞损伤，大量红细胞外溢(见图4)。

3讨论

乳腺癌作为女性最常见、多发的恶性肿瘤之一，其发病率在我国呈逐年上升趋势，发病年龄趋于年轻[2]，对其有效的治疗是延长患者生命、提高生存质量的前提。目前临床治疗乳腺癌以手术为主，对于复发性肿瘤患者、肿块较大患者、不能耐受手术的患者等，化疗是必不可少的治疗手段。乳腺癌全身化疗时，药物对目标的选择性不高，在杀伤肿瘤细胞的同时，体内一些分裂增殖活跃的正常细胞或组织可能被误伤，从而出现不同种类或不同程度的副作用，因此寻找一种提高肿瘤组织局部药物浓度、减少全身化疗剂量的方法十分必要。本研究采用脉冲式超声治疗仪联合静脉注射微泡造影剂的方法，探讨超声击破微泡对荷瘤兔乳腺癌的治疗效果。

图2　治疗前后，乳腺癌荷瘤超声造影时间-强度曲线图，治疗后较治疗前明显降低

图3　超声微泡组治疗前后造影的峰值强度变化图像

超声空化是微气泡在超声波作用下被激发，产生震荡、膨胀、收缩以及爆破等一系列动力学过程。研究表明[3-4]，在组织中含有微泡剂时，低剂量超声即可产生过去高功率超声才能诱导的空化效应，又可避免和减少高强度超声对周围正常组织的损伤。微泡造影剂作为空化核，可通过增加空化核的浓度，增强空化效应，并减少产生空化效应所需的超声能量。同时超声激励微泡空化可直接作用于供应肿瘤组织营养的微小血管网，致肿瘤及其周围组织中的微小血管破损，阻断肿瘤区域新生血管，抑制肿瘤生长。近年来，国内外已有较多学者将微泡介导的超声空化成功用于药物靶向释放[5]、提高微血管的通透性[6]、可逆性开放血脑屏障和促大分子物质跨血脑屏障转运[7]等。

图4HE染色结果显示(光镜下×40)，正常肿瘤组织呈实体状瘤细胞条索状排列，细胞核大深染，异型明显，超声微泡治疗后肿瘤组织出血，大量红细胞外溢。

本研究采用荷瘤兔VX2肿瘤模型，利用脉冲式聚焦超声，通过经静脉注射一定剂量微泡联合超声空化作用，初步实现了肿瘤微小血管的阻断作用，表明了微泡增强的超声空化对荷瘤兔乳腺癌肿瘤的一定作用效果。经文献报道发现，超声微泡对局部组织的生物学作用的影响因素主要有三个方面：①微泡本身的特性，微泡作为外源性的"空化核"可降低空化阈值并且能加大生物学损害的程度。②发射超声本身的参数，优化超声参数，在尽量降低不良反应的基础上释放出更多能量，产生更多的外溢孔，使更多基因或药物外溢到组织间隙, 提高超声微泡基因、药物传输效率。③微泡局部浓度及超声微泡作用的局部环境，提高靶组织的微泡浓度可提高空化效应，另外肿瘤新生血管内皮细胞间隙大，基底膜不完整，为空化效应提供了有利的局部环境。

本研究结果表明，以发射频率1MHz，声压3Mpa，占空比0.2%条件下，治疗前肿瘤组织呈高灌注状态，治疗后几乎肿瘤区造影灰阶值明显下降，说明该条件下对荷瘤兔肿瘤有一定的空化治疗效果。本研究仅设一个条件下空化作用效果，但为以后不同声压下对肿瘤治疗效果的研究提供了基础。

参考文献：

[1] 李秋颖，刘政，李佩琼，等.微泡介导下脉冲式聚焦超声空化导致血管损伤的实验研究[J]. 中国超声医学杂志，2008，24(4):297-299.

[2] SEPAROVIC R,BAN M,SILOVSKA T,et al. Clinical guidelines for diagnosistreatment and monitoring of patients with invasive breast cancrer-croatian oncology socity[J]. Lijec Vjesn.2015,137(5-6):143-149.

[3] XIE B,LI YY,JIA L,et al. Experimental ablation of the pancreas with high intensity focused ultrasound (HIFU) in a porcine model[J]. Int J Med Sci,2010,8(1):9-15.

[4] LIU JH,XIAO SY,WU SZ,et al. Disruptionof splenic circulation using microbubble-enhanced ultrasound and prothrombin: a preliminary study[J]. Ultrasound in Medicine and Biology,2012,38(11):1930-1937.

[5] IWANAGA K,TOMINAGA K,YAMAMOTO K, et al. Local delivery system ofcytotoxic agents to tumors by focused sonoporation[J]. Cancer Gene Therapy,2007,14(4):354-363.

[6] 萧淑宜，柳建华，区文财,等．超声击破微泡对犬睾丸组织及细胞影像的研究[J]. 中华超声影像学杂志，2012，21(8)：723-726.

[7] WANG F,SHI Y,LU L，et al. Targeted delivery of GDNF through the blood-brainbarrier by MRI-guided focusedultrasound[J]. Plos One,2012,7(12):e52925.

基金项目：广州市医药卫生科技项目(20131A011001)；广东省自然科学基金面上项目(S2013010016277)；广东省公益研究与能力建设专项资金项目(2014A020212014)

通信作者：柳建华，E-mai：liujianhua666666@163.com

DOI：10.3969/j.issn.1000-8535.2016.02.011

(收稿日期：2016- 01-22)

Experimental study of the effect using microbubbles-enhanced ultrasound cavitation on VX2 breast tumor in rabbits

WeiHongqin，YuMeiling，WeiYingli，etal.

DepartmentofUltrasound,GuangzhouFirstPeople’sHospitalAffiliatedtoGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510180,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the treatment effect of microbubbles-enhanced ultrasound cavitation on VX2 breast tumor in rabbits.MethodsThe rabbit model of VX2 breast tumor were established. The rabbits were randomly divided into two groups, microbubbles-enhanced ultrasound (US+MBs) group and standard ultrasound (US) group. The VX2 breast tumor perfusion were imaged and assessed using contrast enhanced ultrasonography (CUES) before and after treatment.Results The contrast enhanced grayscale value (GSV) of VX2 breast tumors decreased significantly in the US+MBs group, from 20.26±0.59(before treatment) to 3.71±.761 (after treatment)(P<0.01). While there was no significance of GSV before and after treatment (P>0.05) in the US group.ConclusionMicrobubble-enhancement ultrasound cavitation has a certain therapeutic effect on the VX2 breast tumor in rabbits.

【Key words】Ultrasound cavitation; Microbubbles; Breast tumor