杜仲对兔蛛网膜下腔出血后血清中ET-1和eNOS的影响*

柏鲁宁　浩育盈　畅　涛　侯　文　范晓璇　罗　卫　张　毅

陕西中医药大学附属医院脑外科(咸阳 712000)



杜仲对兔蛛网膜下腔出血后血清中ET-1和eNOS的影响*

柏鲁宁浩育盈∆畅涛侯文范晓璇罗卫张毅

陕西中医药大学附属医院脑外科(咸阳 712000)

摘要目的：探讨杜仲对兔蛛网膜下腔出血后血清中ET-1和eNOS的影响及其意义。方法 ：48只日本大耳白兔随机分为模型组和杜仲组，每组又分为第3天组、第5天组、第7天组及第10天组,每小组6只，采用枕大池二次注血法建立蛛网膜下腔出血模型, 按Endo标准对实验动物进行评分，通过放射免疫法动态测定血清中ET-1和eNOS的变化。结果： 与模型组比较，杜仲组动物神经功能评分较低，杜仲组血清中ET-1水平较低，而eNOS水平较高，并且在造模后第3天，第5天，第7天差异有统计学意义(P<0.05)。结论： 杜仲能降低兔蛛网膜下腔出血后血清中ET-1水平，而增加eNOS的水平，改善实验动物的神经功能评分。

主题词蛛网膜下腔出血/中医药疗法杜仲/治疗应用动物实验兔

蛛网膜下腔出血(Subarachnoidhemorrhage，SAH)是一种临床常见的急症，其死亡率和致残率一直高居不下，SAH后引起的脑血管痉挛(Cerebralvascularvasospasm,CVS)是不良预后的主要原因[1]。目前, 西医对SAH后CVS的治疗，主要包括尼莫地平、氧自由基清除剂、内皮素受体抑制剂、他汀类及抗炎药物等。这些药物在一定程度上改善了CVS, 提高了SAH的预后，然而这些药物目前大多仅仅局限于动物实验中[2]。杜仲是我国传统中药材，具有扩张动脉血管、降压、抗氧化、抗炎等作用[3]，但是否能缓解SAH后CVS，目前文献报道较少。在本研究中，我们采用兔枕大池二次注血法建立CVS模型,动态观察CVS病理过程中血浆中内皮素1(Endothelin-1ET-1)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的变化及杜仲对其的影响，为CVS的治疗提供新思路。

1材料与方法1.1实验分组和造模日本大耳白兔48只，体重2.5～3.2Kg，平均2.8±0.62Kg,雌雄不限，由西安交通大学医学部动物中心提供。将实验动物随机分为2大组：模型组和杜仲组各24只，每组又分为第3天组、第5天组、第7天组及第10天组,每小组6只。分别在第2次注血后第3天，第5天，第7天，第10天经耳中央动脉抽血2ml后快速处死。

模型的建立参照文献[4]，造模成功后，模型组常规喂养，杜仲组在常规喂养的基础上，每日杜仲煎剂5ml/Kg灌胃2次。

1.2标本处理经兔耳中央动脉取血2ml,置于预先加入10%乙二胺四乙酸二钠(EDTA)30ul和抑肽酶40ul的试管内,混匀,在4°C,3000r/m离心10min,分离上清液,放于-80°C的冰箱内保存。测定前,把标本在室温或冷水中复融,再次4°C,3000r/m离心5min,取上清液测定,分离上清液按照ET-1、eNOS试剂盒说明进行测量。

1.3神经功能评分观察建模后第3天，第5天，第7天，第10天神经缺损症状进行功能性评分。按Endo标准[5]将兔神经功能障碍分为4 级。

2结果2.1神经功能评分模型组和杜仲组都出现神经功能障碍，而且在造模后第5天最为严重，第10天还有轻度神经功能障碍，两组神经功能评分的比较第3天、 第5天、 第7天小组差异有统计学意义,见表1。

2.2血清ET-1水平 两组血清ET-1水平在第2次注血后5d达到最高，至第7天开始下降，但杜仲组血清ET-1水平较模型组低，与模型组比较，杜仲组第3天、 第5天、 第7天小组差异有统计学意义，见表2。而血清eNOS水平在第2次注血后5d降到最低，至第7天开始升高，但杜仲组血清eNOS水平较模型组高，与模型组比较，杜仲组第3天、 第5天、 第7天小组差异有统计学意义,见表3。

表1　各组动物的神经功能评分

注：与模型组比较，△P<0.05

表2　SAH后各组动物血清ET-1的变化

注：与模型组比较，△P<0.05

表3　 SAH后各组动物血清eNOS的变化

注：与模型组比较，△P<0.05

3讨论SAH是临床常见的一种出血性卒中类型，其死亡率和致残率一直高居不下，SAH后引起的CVS是不良预后的主要原因[1]。近年来对SAH后的病理机制进行了大量的实验和临床研究，其可能的机制主要包括溶血产物的刺激、血管内皮细胞功能障碍、细胞内信号转导和血管壁炎症反应及细胞凋亡等[6]，比较公认的观点是SAH后血管内皮细胞功能障碍是引起CVS的主要原因。

ET-1是血管内皮细胞分泌的主要缩血管物质之一, 由212个氨基酸残基组成, 最终由皮素转化酶将其剪切成具有活性的成分，其生物效应通过2种亚型的受体(ETA、ETB)介导，ETA受体主要位于血管平滑肌细胞, 具有介导血管收缩和增殖作用，对脑血管的痉挛起着决定性作用[7-8]。近年来，大量的临床和实验研究表明，SAH后血清中ET-1含量增高，内皮素受体的拮抗剂、内皮素转换酶的抑制剂可以抑制ET-1含量的增高，并能改善脑血管痉挛[9]。

NO是最主要的血管舒张因子之一，是由一氧化氮合酶(Nitricoxidesynthase,NOS)催化L-精氨酸而生成的，NOS有三种亚型，其中eNOS主要分布于血管内皮细胞，其催化释放的NO主要维持血管的舒张状态[10]。脑血管中NO的主要要作用是松弛血管平滑肌细胞，NO激活了cGMP依赖的蛋白激酶, 经过细胞外信号转导, 引起肌球蛋白轻链脱磷酸、钾离子通道激活, 伴随电压依赖的钙离子通道的关闭, 最终导致血管平滑肌细胞的松弛。SAH后eNOS下调，而且功能受到抑制，导致NO的水平降低及其舒血管效应的缺失在CVS中起重要作用[7]。

本实验结果表明，与模型组比较，杜仲组动物神经功能评分较低，杜仲组血清中ET-1水平较低，而eNOS水平较高，并且在造模后第3天，第5天，第7天差异有统计学意义。杜仲作为中药在我国已有悠久的历史，在《神农本草经》、《本草纲目》中都有记载，味甘，性温，归肝、肾经。现代研究表明其具有扩张动脉血管、降压、抗氧化、抗炎等作用[11]。根据本文结果推测，在SAH后的CVS发展过程中，杜仲能增加兔血清eNOS含量，降低ET-1，减轻脑血管痉挛改善实验动物的神经功能症状。杜仲具有多种药理作用，包含多种生物活性物质，其有效的单体和缓解CVS的进一步机制还有待深入研究。

参考文献

[1]VanGijnJ,KerrRS,RinkelGJ.Subarachnoidhaemorrhage[J].Lancet， 2007, 369(9558):306-318.

[2]宋锦宁,安吉洋. 蛛网膜下腔出血后早期脑损伤及神经保护治疗的研究进展[J]. 西安交通大学学报(医学版), 2013，34(6):695-703.

[3]冯晗,周宏灏,欧阳冬生.杜仲的化学成分及药理作用研究进展[J]. 中国临床药理学与治疗学, 2015,20(6):713-720.

[4]柏鲁宁,周雄波,赵晓平,等. 一种兔脑血管痉挛模型的建立[J]. 汕头大学学报，2008,21(4):199-201.

[5]CarpiA，NicoliniA，AntonelliA，etal.Cytokinesinthemanagementofhighriskoradvancedbreastcancer：anupdateandexpectation[J].CurrCancerDrugTargets，2009,9(8):888-903.

[6]KamilG,MervynDI,RickM,etal.Effectofendothelinreceptorantagonistsonclinicallyrelevantoutcomesafterexperimentalsubarachnoidhemorrhage:asystematicreviewandmeta-analysis[J].JournalofCerebralBloodFlow&Metabolism, 2015, 35(7):1085-1089.

[7]赵旭东, 史继新.蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛发病机制及治疗的研究进展[J]. 医学研究生学报, 2010,23(2):218-222.

[8]刘昊,王海涛.大鼠蛛网膜下腔出血脑基底动脉内皮素受体表达的变化 [J].陕西医学,2009，38(4):402-404.

[9]CiureaAV,PaladeC,VoinescuD,etal.Subarachnoidhemorrhageandcerebralvasospasm-Literaturereview[J].JournalofMedicineandLife,2013,6(2):120-125.

[10]李鸣华,姚鑫.内皮素-1、一氧化氮和一氧化氮合成酶在蛛网膜下腔出血中的作用机制探讨[J].国际神经病学神经外科学杂志,2007,34(4):389-392.

[11]王志宏，彭胜，雷明盛,等 .杜仲主要生物活性研究进展[J].天然产物研究与开发,2013，25(9): 1302-1309.

(收稿2016-03-28；修回2016-04-19)

通讯作者∆

【中图分类号】R743.35

【文献标识码】A

doi:10.3969/j.issn.1000-7369.2016.08.074

*陕西省科学技术研究发展计划项目(2011K12-74)