变换波长HPLC同时测定决明子中橙黄决明素和大黄酚的含量

王云霞　张　鑫

西安市食品药品检验所(西安 710054)



·方药纵横·

变换波长HPLC同时测定决明子中橙黄决明素和大黄酚的含量

王云霞张鑫

西安市食品药品检验所(西安 710054)

摘要目的：考察不同波长和酸度对HPLC法测定决明子中橙黄决明素和大黄酚的含量的影响。方法：采用Welch C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱，以乙腈-0.1%磷酸为流动相梯度洗脱(0-15 min 40∶60，15-50 min 40→84；60→16，50-60 min 84∶16) 柱温30℃，流速1.0 ml/min,检测波长284 nm(橙黄决明素)和254 nm(大黄酚)。结果：橙黄决明素和大黄酚分别在0.01078～1.078μg，0.00741～0.741μg范围内峰面积呈良好的线性关系，相关系数r=0.9999。橙黄决明素和大黄酚的平均回收率分别为101.0%(RSD=0.8%)和99.8%(RSD=0.72%)。结论: 该方法具有准确度高，重复性好等优点，为决明子药材质量标准的改进提供一定依据。

主题词决明子色谱法，高压液相 @橙黄决明素 @大黄酚

决明子为豆科植物决明或小决明的干燥成熟种子，具有清热明目，润肠通便的作用，临床主要用于目赤涩痛，头痛眩晕，目暗不明，大便秘结等症状[1-2]。决明子中的主要成分有蒽醌类，目前对其研究主要有单波长高效液相色谱法[2-4]，液质连用[5]，指纹图谱法[6]对其化学成分和有效成分进行测定。本文通过采用变换波长HPLC法同时测定决明子中橙黄决明素和大黄酚的含量，并研究酸度对其含量测定的影响，经过方法学验证，该方法具有精密度高，重现性好的优点，可以用于决明子药材的质量控制。

1仪器与试药Agilent1260高效液相色谱仪；WelchC18(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱；BT124S型电子天平(德国赛多利斯)，对照品：橙黄决明素(批号111900-201303)，含量为99.1%，大黄酚(批号110796-201017)，含量为99.6%，对照品均购于中国药品生物制品检定所，供含量测定使用，决明子药材经西安市食品药品检验所中药室谢志民主任药师鉴定为豆科植物决明的干燥种子，甲醇为分析纯，乙腈为色谱纯，水为娃哈哈纯净水，盐酸为分析纯，其它试剂均为分析纯。

2方法与结果2.1色谱条件WelchUltimateXB-C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，流动相：以乙腈-0.1%磷酸为流动相梯度洗脱(0-15min40∶60，15-50min40→84；60→16，50-60min84∶16) 柱温30℃，流速1.0ml/min，检测波长284nm(橙黄决明素)和254nm(大黄酚)。进样量：10μL，在此条件下测定对照品和供试品溶液，见图1。

2.2对照品溶液的制备 精密称取橙黄决明素10.88mg和大黄酚7.44mg至100ml容量瓶中，加无水乙醇-乙酸乙酯(2∶1)混合溶液稀释至刻度，作为对照品储备液，后经稀释制成每1ml含橙黄决明素、大黄酚分别约为20μg/ml，作为对照品溶液。

2.3供试品溶液的制备精密称取本品粉末(过三号筛)0.5g，精密加入甲醇50ml，称定重量，加热回流2h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml，蒸干，加稀盐酸30ml置水浴中加热水解1h，立即冷却，用三氯甲烷振摇提取4次，每次30ml，合并三氯甲烷液，回收溶剂至干，残渣用无水乙醇-乙酸乙酯(2∶1)混合溶液溶解，转移至25ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

2.4标准曲线的制备 分别精密吸取橙黄决明素和大黄酚对照品储备溶液1ml，3ml，5ml，5ml分别稀释至100ml，25ml，25ml，10ml和储备液进样10μL进行线性回归，橙黄决明素和大黄酚的回归方程分别为：Y=7198.122X-6.692，r=0.9999，大黄酚Y=5342.143X+26.444，r=0.9999,分别在0.01078～1.078μg，0.00741～0.741μg范围内具有良好的线性关系。

2.5精密度试验 精密吸取供试品溶液10μL, 连续进样6次，进行测定，供试品溶液中橙黄决明素和大黄酚的的RSD分别为0.51%，0.38 %，结果表明该方法的精密度良好。

2.6稳定性试验 精密吸取供试品溶液10μL, 分别在0, 2，4，8，12，24h测定，结果橙黄决明素和大黄酚的的RSD分别为0.26%，0.43 %，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。

2.7重复性试验取同一批决明子药材，按照“2.3”项下的方法制备6份供试品溶液，进样量10μL，结果橙黄决明素的平均含量为0.128%，RSD为1.21%，大黄酚的平均含量为0.107%，RSD为1.04%，表明本方法的重复性良好。

2.8加样回收率试验 精密称取已知含量的供试品6份，然后分别加入一定量的橙黄决明素和大黄酚的对照品，按照含量测定项下的方法进行测定，分别计算橙黄决明素的平均回收率为99.8%，RSD=1.25%，大黄酚的平均回收率为101.2%，RSD=1.72%。

2.9样品含量的测定 精密称取决明子粉末(过3号筛)0.5g，按照供试品溶液的制备方法和色谱条件进行测定，计算橙黄决明素和大黄酚的含量，结果如下：橙黄决明素含量分别为0.240%，0.119%，0.126%，大黄酚的含量分别为0.110%，0.115%，0.103%。

3讨论 色谱条件的选择：2010年版药典中决明子含量测定采用同一波长284nm对橙黄决明素和大黄酚进行检测，2015版仍未做修改，但是笔者在实验中发现284nm下测定大黄酚具有一定的局限性，在做薄层鉴别时发现大黄酚的斑点非常明显，而在液相色谱中，大黄酚峰面积较小，干扰大，当含量较低时，不易检测，故本实验采用变换波长法在284nm下检测橙黄决明素，在254nm下检测大黄酚，会大大减少干扰，提高检测灵敏度。实验采用不同比例的乙腈-0.1%磷酸为流动相进行等度洗脱，结果发现分离度不好，故采用本实验的梯度进行洗脱，结果分离度均达到实验要求。供试品溶液制备的考察，采用正交实验对制备过程中水解HCl溶液浓度(5%，10%，15%)水解时间分别为(0.5h，1h，1.5h)进行考察，得到最佳方法为HCl浓度为10%，水解时间为1h时含量最高，并且我们用9种供试液对原波长进行了考察，发现无论哪个条件下的大黄酚峰面积变化不大，而在254nm下检测大黄酚变化非常明显，以本实验条件为最佳。

参考文献

[1] 国家药典委员会.中华人民共和药典[M]. 北京：中国医药科技出版社，2015：145.

[2] 张丽军. 决明子滴丸提取工艺的研究[J]. 陕西中医, 2014,35 (11):1552-1553.

[3]刘富,谢志民, 傅强.变化波长高效液相色谱法同时测定鬼箭羽槲皮素和山奈酚的含量[J]. 陕西中医,2013, 34(5):598-599.

[4] 雷杨,韩宇.HPLC法测定益肾降糖丸中橙黄决明素的含量[J].临床医药文献电子杂志, 2015，(10):1794-1795.

[5] 骆宜,张乐,王卫华,等.高效液相色谱-离子阱-飞行时间质谱鉴定决明子化学成分[J]. 药物分析杂志,2015，(8):1408-1416.

[6] 杨美丽,张少杰,杨金蕊,等.决明子的特征图谱研究及质量分析[J].中国药业, 2015，(22):75-78.

(收稿2016-03-22；修回2016-05-15)

【中图分类号】282.71

【文献标识码】A

doi:10.3969/j.issn.1000-7369.2016.08.067