颅内动脉瘤并心肌损伤与交感活性亢进关系的实验研究

方志成，周昌娥，张浩明

(湖北医药学院附属十堰市太和医院，湖北 十堰 442000)



颅内动脉瘤并心肌损伤与交感活性亢进关系的实验研究

方志成，周昌娥，张浩明

(湖北医药学院附属十堰市太和医院，湖北 十堰 442000)

[摘要]目的探讨颅内动脉瘤并心肌损伤与交感活性亢进关系，以期明确其发病机制，寻找有效防治方法。方法选取80只日本大耳白兔，采用改良胰弹性蛋白酶诱导动脉瘤方法制作动脉瘤模型，根据心肌酶谱、心电图变化等筛选心肌损伤动物并以此分为心肌损伤组和非心肌损伤组，经酶联免疫吸附法测定2组术前及术后1，2，3周血浆去甲肾上腺素、肾上腺素浓度。术后3周处死动物，染料法荧光定量测定兔心肌组织中β2肾上腺素能受体mRNA表达情况。结果心肌损伤组术后血浆去甲肾上腺素、肾上腺素浓度均明显高于术前(P均<0.05)，术后2周达峰值，第3周开始下降，而非心肌损伤组围术期血浆去甲肾上腺素、肾上腺素浓度无明显变化(P均>0.05)；同期组间比较，心肌损伤组血浆去甲肾上腺素、肾上腺素浓度均明显高于非心肌损伤组(P均<0.05)。染料法荧光定量显示心肌损伤组心肌局部组织中β2肾上腺素能受体mRNA表达量明显低于非心肌损伤组(P<0.05)。结论动脉瘤并发心肌损伤可能与机体交感活性兴奋甚至亢进、儿茶酚胺大量释放，引起心肌毒性损伤有关。

[关键词]颅内动脉瘤；心肌损伤；交感活性；儿茶酚胺

临床颅内动脉瘤蛛网膜下腔出血患者易发生心血管并发症，其以心律失常、心肌受损、心功能不全等为主要特点，导致病情复杂化[1-2]。目前其发生机制尚不明确，缺乏有效防治手段，导致住院时间延长、医疗费用增加，明显增加患者病死率，并易引发医疗纠纷[3-4]。本研究应用改良胰弹性蛋白酶诱导动脉瘤方法制作颅内动脉瘤动物模型，并根据心电图、心肌损伤标志物检查等筛选合并心肌损伤动物，探讨交感神经兴奋、亢进与心肌损伤发生的关系，旨在明确颅内动脉瘤并发心肌损伤的病理生理机制，为进一步寻找防治策略奠定理论基础。

1实验资料

1.1实验动物健康日本大耳白兔80只，3～6月龄，体质量2～2.5 kg，雌雄不限，湖北医药学院实验动物中心提供，动物合格证号：NO.42000900000184。实验前所有动物自由饮水、进食。

1.2方法

1.2.1颅内动脉瘤模型制作经兔耳缘静脉给予10%乌拉坦静脉麻醉，沿颈部正中切口，分离筋膜，暴露气管，在气管右侧游离出右颈总动脉(RCCA)，继续向近心端方向游离直至右颈总动脉与右锁骨下动脉(RSCA)分叉处，在距RCCA与RSCA分叉处上方2.5 cm处，结扎RCCA，然后动脉瘤夹夹闭RCCA与RSCA分叉，在距RCCA与RSCA分叉上方1.5 cm处，用26 G静脉留置针(内径0.6 mm，长度1.5 cm，流量15 mL/min)穿刺RCCA并注入75 IU猪胰弹性蛋白酶，最后松开RCCA远心端结扎，并移除动脉瘤夹[5]，注意观察穿刺口渗血情况。术中因失血性休克死亡7只，成功制作动物模型73只。术后8 h开始进水、食物，每日给予青霉素20万IU肌注预防感染，观察动物术后神志、肢体活动情况，并做记录。

1.2.2研究分组对所有实验动物测定血浆肌钙蛋白I、脑型利钠肽浓度，行心脏超声、心电图等相关检查，根据检测结果将造模成功白兔分为心肌损伤组42只和非心肌损伤组31只。心肌损伤确定依据：心肌损伤标志物升高、心电图各导联有ST段下移、抬高等，或心脏超声发现心功能异常、室壁运动异常等现象均认为合并心肌损伤。

1.2.3血浆儿茶酚胺浓度检测术前及术后1周、2周、3周经兔耳缘静脉取静脉血4 mL,室温血液自然凝固10～20 min，2 000～3 000 r/min离心20 min左右，收集上清，用ELSIA法测定不同时间血浆肾上腺素、去甲肾上腺素浓度。

1.2.4心肌组织中β2肾上腺素能受体mRNA检测术后3周处死实验动物后，取小块心肌组织，RNAsimple Total RNA Kit提取细胞总RNA，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测提取质量，ND-1000(NanoDrop Technologies，USA)提取浓度和纯度。BioBRK RT Kit迅速合成cDNA：20 μL总体系含1 μg RNA，2.5 μmol/L的Oligo(dT)18，1× RT缓冲液，1 mmol/L每种dNTP，100 IU的ReverTra Ace，5unit 的Super-RI，0.5 μL 的RT-Enhancer， 无RNase 水加至终体积。逆转录程序：42 ℃ 40 min，99 ℃ 5 min 灭活逆转录酶。合成的cDNA用灭菌蒸馏水稀释5倍，-20 ℃ 保存备用。SYBR GreenⅠ染料法实时荧光定量PCR法检测β2肾上腺素能受体mRNA表达：以GAPDH基因为内参，设计GAPDH和β2肾上腺素能受体基因荧光定量引物，为避免DNA污染，上下游引物设计位点均应跨越基因的相邻外显子。反应条件为：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性8s，60℃退火及延伸32s，共进行40个循环，结果采用2-△△CT法进行分析。RT-PCR反应体系10 μL:SYBR®Premix Ex Taq TMⅡ(2×)5 μL， ROX reference Dye Ⅰ(50×)0.2 μL， GAPDH or β3-AR Forward Primer(10 μM)0.4 μL，GAPDH or β3-AR Reverse Primer(10 μM)0.4 μL， cDNA 500 ng， ddH2O加至总体积到10 μL。置于ABI实时荧光定量PCR仪上进行反应，评估心肌组织中β2肾上腺素能受体mRNA表达情况。

2结果

2.1造模动物情况心肌损伤组动物伤口恢复时间略慢于非心肌损伤组，进食也稍差。但2组动物均可自由活动，伤口愈合良好，术后意识清楚，无肢体活动障碍。

2.2血浆儿茶酚胺浓度变化心肌损伤组术后血浆去甲肾上腺素、肾上腺素浓度均明显高于术前(P均<0.05)，术后2周达峰值，第3周开始下降，而非心肌损伤组围术期血浆去甲肾上腺素、肾上腺素浓度无明显变化(P均>0.05)；同期组间比较，心肌损伤组血浆去甲肾上腺素、肾上腺素浓度均明显高于非心肌损伤组(P均<0.05)。见表1。

2.3局部心肌组织中β2肾上腺素能受体mRNA表达情况非心肌损伤组与心肌损伤组β2肾上腺素能受体mRNA表达量分别为1.03±0.06和 0.79±0.03，心肌损伤组β2肾上腺素能受体mRNA表达量明显低于非心肌损伤组(P<0.05)。

表1　2组不同时间儿茶酚胺浓度变化

注：①与术前比较，P<0.05；②与非心肌损伤组同期比较，P<0.05。

3讨论

颅内动脉瘤合并心肌损伤临床常见，前期研究发现，颅内动脉瘤蛛网膜下腔出血后中枢性交感神经兴奋，导致交感神经末梢释放去甲肾上腺素、肾上腺素，后者作用于心肌，发生儿茶酚胺毒性作用，终致心肌损伤[2]。本研究结果发现，合并心肌损伤的颅内动脉瘤动物模型，术后血浆肾上腺素、去甲肾上腺素浓度逐渐升高，术后2周达到高峰，术后3周开始下降；心肌损伤组心肌局部组织中β2肾上腺素能受体mRNA表达明显下降，而非心肌损伤组则无上述变化。提示动脉瘤并发心肌损伤可能与机体交感活性兴奋甚至亢进、儿茶酚胺大量释放有关。分析原因可能为：①交感神经系统兴奋，交感神经末梢释放大量肾上腺素、去甲肾上腺素等儿茶酚胺，其与心肌表面包括β2受体在内的肾上腺素能受体结合，产生儿茶酚胺毒性作用，临床出现心律失常、心电图ST段变化、肌钙蛋白等心肌损伤标志物升高、甚至心肌室壁运动异常等心功能不全表现[6-7]。②氧化应激损伤。多个研究已经明确，去甲肾上腺素可诱导体外细胞模型中心肌细胞损伤，导致心肌细胞超氧化物歧化酶(SOD)活力明显降低，丙二醛(MDA)含量明显升高，应用肾上腺能受体阻断药后SOD升高而MDA含量明显下降，说明机体交感神经活性兴奋可诱导氧化应激反应进而导致心肌损伤[8-9]。③心肌冠脉血管功能失调。交感神经兴奋，血浆儿茶酚胺浓度升高，作用于心肌冠脉血管内皮相应受体，导致冠脉血管收缩、舒张功能失调，继之心肌细胞缺氧缺血，心肌细胞电生理异常，临床出现各种类型心律失常，心肌细胞缺血严重时，还会导致心肌细胞器质性损伤，包括肌钙蛋白I在内的心肌损伤标志物升高，心功能受损[10]。④心肌无菌性炎症。动脉瘤蛛网膜下腔出血，体内交感神经末梢释放大量儿茶酚胺，其通过免疫细胞上α、β肾上腺素能受体产生免疫调节作用[11]，激活机体心肌局部炎症因子，炎症递质大量释放，心肌局部炎症反应综合征与抗炎反应综合征比例失调，炎症反应剧烈，加剧心肌损伤。⑤能量代谢异常，心肌细胞能量不足。颅内动脉瘤蛛网膜下腔出血合并心肌损伤时，机体应激状态下儿茶酚胺分泌增多，营养物质代谢异常，血中糖酵解增强，产生乳酸增多，ATP下降，心肌细胞钠钾泵功能失常，心肌细胞收缩、舒张功能及电生理功能受损；另外应激时，儿茶酚胺是较强的脂解激素，其介导β2受体激活，导致脂肪分解加速，酮体大量生成，心肌细胞能量来源不足，心肌受损[12]。⑥激素允许作用。哺乳动物体内存在糖皮质激素，通过经典的基因组机制促进儿茶酚胺的生物合成或增加血管平滑肌细胞膜上儿茶酚胺受体数量，及调节受体介导的细胞信息传递过程，从而增加心血管系统对儿茶酚胺缩血管物质的敏感性[13]，在交感神经兴奋、亢进的情况下，激素允许作用强化，扩大儿茶酚胺心肌毒性作用，加剧心肌损伤。

本研究已初步证实颅内动脉瘤蛛网膜下腔出血合并心肌损伤动物模型中，血浆肾上腺素、去甲肾上腺素浓度明显上升，随时间推移逐步上升直至术后2～3周，此时间动脉瘤正在形成，也易于合并心肌损伤，同时术后心肌局部组织中β2肾上腺素能受体mRNA表达明显下降，说明交感活性亢进、儿茶酚胺大量释放甚至儿茶酚胺毒性是引起动脉瘤并发心肌损伤的重要原因，为今后寻找有效治疗方法提供了理论依据。本研究不足之处在于：①动物模型交感神经兴奋、亢进原因除与动脉瘤原发疾病有关外，手术创伤、机体应激也是原因之一，两方面因素叠加在一起是否会干扰实验结果，手术早期这种影响可能更为突出？②本研究在颈部制作动脉瘤模型，虽然动脉瘤组织形态学、病理学特征与颅内动脉瘤高度相似，但哺乳动物颈部存在颈动脉窦，颈部交感神经分布丰富，动脉瘤在形成过程中可能也会诱发颈部交感神经兴奋，释放儿茶酚胺，可能干扰研究。③目前关于交感神经兴奋、亢进的临床检测方法不多，手段有限，不能全面、深入的观察、分析交感神经功能变化。④心肌损伤原因众多，本研究仅关注交感神经兴奋所释放的儿茶酚胺毒性对心肌损伤作用，除此以外尚有其他原因。⑤如果给予肾上腺素能受体阻滞剂如美托乐尔等，是否可以阻断、逆转、恢复心肌损伤，如此，则能更进一步证明颅内动脉瘤蛛网膜下腔出血并发心肌损伤与交感神经兴奋、亢进之间关系。上述这些都需要今后进一步研究。

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[作者简介]方志成，男，主任医师，主要从事急危重症研究。 [通信作者]周昌娥，E-mail:13593751009@139.com

[基金项目]湖北省自然科学基金面上项目(2014CFB314)

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.22.006

[中图分类号]R-332

[文献标识码]A

[文章编号]1008-8849(2016)22-2411-03

[收稿日期]2016-03-10

Experimental study of the relationship between myocardial injury of intracranial aneurysm and hyperfunction of sympathetic activity

FANG Zhicheng, ZHOU Chang’e，ZHANG Haoming

(TaiHe Hospital,HuBei University of Medicin，Shiyan 442000，Hubei,China)

Abstract:Objective It is to explore the relationship between myocardial injury of intracranial aneurysm and hyperfunction of sympathetic activity, thus to find out its mechanism and effective method for prevention and treatment. Methods 80 Japanese big ear rabbit were selected to establish aneurysm models by modified method of pancreatic elastase induction. According to the changes of myocardial enzyme spectrum, electrocardiogram (EKG) the myocardial injury animals were screened and divided into myocardial injury group and non-myocardial injury group.Plasma contents of noradrenaline (NE) and epinephrine (E) were determined by enzyme linked immunosorbent assay in both groups before operation and in 1, 2, 3 weeks after operation.In 3 weeks after operation the animals were killed and the expression of mRNA of β2-adrenoreceptor in myocardial tissue was detected by fluorescence analysis. Results The contents of NE and E were significantly higher after operation compared with that before operation in myocardial injury group(P<0.05), the contents reached peak value at 2 weeks after operation and began to decrease in the third weeks. No significant changes of the contents were found in non-myocardial injury group(P>0.05). The contents in myocardial injury group were higher than that in non-myocardial group at the same stage (P>0.05). Fluorescence quantitative analysis showed that the expression of mRNA of β2-adrenoreceptor in myocardial tissue of myocardial injury group was lower than that in non-myocardial injury group(P<0.05). Conclusion Aneurysm complicating with myocardial injury may be related with hyperfunction of sympathetic activity, much release of catecholamine which could induce cardiac muscle toxicity injury.

Key words:intracranial aneurysm; sympathetic toxicity;catecholamine