复方丹参滴丸对血管性痴呆大鼠海马突触的影响

朱燕珍，何才姑，黄玉梅，江 澍，钱长晖，蒋艺燕，郑雪花，倪艳红，陈小环，陈碧珍，贺建超，袁　　洁（福建中医药大学中西医结合学院，福建 福州 350122）

复方丹参滴丸对血管性痴呆大鼠海马突触的影响

朱燕珍，何才姑，黄玉梅，江 澍，钱长晖，蒋艺燕，郑雪花，倪艳红，陈小环，陈碧珍，贺建超，袁洁
（福建中医药大学中西医结合学院，福建 福州 350122）

目的观察海马突触在血管性痴呆发病机制中的作用及复方丹参滴丸对其影响。方法制备血管性痴呆大鼠模型，用复方丹参滴丸治疗，电镜下观察海马突触结构，western blot法测定海马突触蛋白Ⅰ的表达。结果复方丹参滴丸改善了血管性痴呆大鼠海马突触结构，促进了血管性痴呆大鼠海马突触蛋白Ⅰ表达。结论复方丹参滴丸具有改善血管性痴呆大鼠海马突触结构和突触蛋白Ⅰ表达的治疗作用。

复方丹参滴丸；血管性痴呆；突触；海马；突触蛋白Ⅰ

血管性痴呆（VaD）是指脑缺血缺氧引起脑组织损伤产生的以认知功能障碍为主的临床综合征。近年随着中国人口的老年化，血管性痴呆的患病率和发病率呈指数上升。我们课题组以活血化瘀为治则，用复方丹参滴丸治疗血管性痴呆大鼠，前期研究［1］我们证实复方丹参滴丸可改善血管性痴呆大鼠的认知能力，促进海马CA1区Bax、Caspase 3的表达。本实验从突触角度观察复方丹参滴丸对血管性痴呆大鼠海马突触及突触蛋白Ⅰ的影响，为临床治疗提供实验依据。

1材料

1.1实验动物清洁级SD大鼠24只，体质量（412±35）g，由中国人民解放军医学科学院实验动物中心提供，证书号：SCXK-（军）2007-004，合格证号：0014047。

1.2试剂复方丹参滴丸 （中国天津天士力制药股份有限公司）；突触蛋白Ⅰ兔抗单克隆抗体（美国Cell Signaling公司）；GAPDH兔抗单克隆抗体 （美国Cell Signaling公司）

1.3仪器EM208透射电镜（荷兰飞利浦公司）。

2方法

2.1制备血管性痴呆大鼠模型用双侧颈总动脉结扎法制备血管性痴呆大鼠，步骤如下：10%水合氯醛（3.5 mL/kg）经腹膜腔麻醉大鼠，大鼠取仰卧位固定后，行颈前正中切口，分离双侧颈总动脉以双重丝线结扎，缝合切口。对照组大鼠手术步骤与模型组相似，但分离双侧颈总动脉后不结扎。将存活的模型组大鼠随机分为VaD组和丹参组。

2.2给药术后10 d，丹参组大鼠用复方丹参滴丸治疗，用药量3粒/kg。将复方丹参滴丸溶于1 mL的生理盐水，灌胃，每日1次，治疗20 d。对照组和VaD组在相同条件下给予生理盐水灌胃。

2.3电镜观察海马神经突触颈椎脱位后处死大鼠，开颅取脑，在冰盘上快速分离海马组织。沿海马CA1区纵轴方向切3条1 mm×3 mm×1 mm的海马组织，将其置于3%戊二醛和1.5%多聚甲醛固定24 h，然后浸入1%锇酸和1.5亚铁氰化钾固定1.5 h。以磷酸盐缓冲液漂洗，组织与醋酸双氧铀染色过夜，用乙醇和丙酮梯度脱水，环氧树脂618包埋剂包埋。超薄切片，片厚80 nm，醋酸铀染色5 min，柠檬酸铅染色5 min。在EM208透射电镜下观察，摄影。

2.4Western blot法测定海马突触蛋白Ⅰ的表达

经颈椎脱臼法处死大鼠，开颅取脑，冰上剥离海马，称体质量，加入RIPA裂解液，终溶度为1Mm PMSF匀浆，4℃、14 000 r/min离心10 min，BCA法测定蛋白溶度，加上样缓冲液煮沸5 min。

参照文献［2］进行Western blot实验，其中第一抗体是突触蛋白Ⅰ兔抗单克隆抗体和GAPDH兔抗单克隆抗体（稀释比是1∶1000），第二抗体是辣根酶标记山羊抗兔IgG抗体（稀释比是1∶4 000）。Western blot条带扫描后用Phoretix ID软件计算蛋白条带的OD值并进行半定量分析，实验中GAPDH是内参。

3结果

3.1电镜观察海马神经元突触结构对照组：突触前膜、突触后膜和突触间隙明显，突触前成分有许多突触小泡，突触后成分上有密度高的致密物质，见图1－A。VaD组：突触前、后成分肿胀明显，突触间隙模糊不清，突触前成分内的突触小泡较少，突触后成分内的致密物质变薄，见图1－B。丹参组：与VaD组相比较突触前、后成分表面变得清晰，突触前成分内的囊泡增多，突触后成分内致密物质增厚，突触前、后成分的肿胀减轻，见图1－C。

3.2Western blot法测定海马突触蛋白Ⅰ的表达见表1和图2。VaD组突触蛋白Ⅰ表达的量明显低于对照组（P＜0.05），丹参滴丸治疗改善了VaD组大鼠突触蛋白Ⅰ表达（P＜0.05）。

表1　3组大鼠海马突触蛋白Ⅰ的表达

4讨论

4.1根据“脑髓纯者灵，杂者钝”。清灵之府因淤不能与脏器相接，脑失所养，遂致杂者钝而发病。我们课题组认为血瘀是血管性痴呆的重要发病因素，并以活血化淤为治疗原则。复方丹参滴丸由丹参、三七、冰片组成，丹参具有扩张血管、改善循环、改变血液黏度的作用［1］。我们研究证实复方丹参滴丸明显改善了血管性痴呆大鼠的认知功能［2］。

4.2突触是神经元与神经元之间传递信息的结构，与学习记忆密切相关［3］。双侧颈总动脉结扎可使大鼠海马CA1区突触数量减少和形态结构发生显著变化，导致学习记忆功能障碍［4-6］。中药针灸对海马神经元有一定的保护作用［7－8］。本研究结果显示，VaD组海马突触前、后成分肿胀，间隙模糊不清，突触前成分内小泡减少，突触后成分内的致密物质变薄；丹参组海马突触结构有明显改变，提示突触结构和功能的改善在复方丹参滴丸治疗血管性痴呆大鼠时发挥重要作用。

4.3突触蛋白Ⅰ是选择性位于突触前成分内的一种囊泡膜蛋白，具有调节神经递质释放和促进突触发生的作用，与认知功能密切相关［9］。本研究结果显示，与对照组比较，VaD组突触蛋白Ⅰ表达减少，复方丹参滴丸可促进血管性痴呆大鼠海马突触蛋白Ⅰ的表达，提示突触蛋白Ⅰ的增加在复方丹参滴丸治疗血管性痴呆时发挥重要作用。

［1］朱燕珍，叶小包，王晅，等.复方丹参滴丸对血管性痴呆大鼠海马CA3区Bax、Caspase-3表达的影响［J］.福建中医药大学学报，2011，21（3）：16-19.

［2］ZHU Y Z，ZENG Y J，WANG X，et al.Effect of electroacupuncture on the expression of mTOR and eIF4E in hippocampus of rats with vascular dementia［J］.Neurol Sci，2013，34（7）：1093-1097.

［3］古训瑚，刘志强，徐丽君.突触改变与阿尔茨海默病关系的研究进展［J］.广东医学，2015，36（3）：478-480.

［4］MEYER D，BONHOEFFER T，SCHEUSS V.Balance and stability of synaptic structures during synaptic plasticity［J］.Neuron，2014，82（2）：430-443.

［5］HUANG S Q.Effect of Erythropoietin on plasticity of nervous synapse in CA1 region of hippocampal of vascular dementia （VaD）rats［J］.African Journal of Pharmacy and Pharmacology，2012，6（15）：1111-1117.

［6］LI H Y，XIN X Y.Nitrogen dioxide（NO2）pollution as a potential risk factor for developing vascular dementia and its synaptic mechanisms［J］.Chemosphere，2013，92（1）：52-58.

［7］林羽，徐伟，张玉琴，等.栝楼桂枝颗粒抗缺血性脑卒中大鼠神经元及原代海马神经元凋亡研究［J］.康复学报，2015，25 （1）：38-43.

［8］陈兰芳，张学君，林栋，等.电针长强穴对FMRI基因敲除小鼠海马CA1区PSD-95、CREB蛋白表达的影响［J］.康复学报，2015，25（4）：18-21，26.

［9］苑振云，姜相明，顾平，等.不同饲养环境对快速老化小鼠学习记忆能力和海马突触蛋白Ⅰ的影响［J］.中国老年学杂志，2013，33（17）：4196-4198.

R285.5

B

1000-338X（2016）03-0020-02

2016-03-02

福建省自然科学基金资助课题（2013J01331），国家级大学生创新创业训练计划项目资助课题（201510393008）

朱燕珍（1976—），女，副教授，主要从事脑血管病的基础研究。