异补骨脂素对氧化损伤的HLEC线粒体超微结构的影响

冯春燕，陈　　胜，胡艳红，柯发杰，胡　　俊，黄秀榕，祁明信（.福建中医药大学附属第二人民医院，福建 福州 350003；.福建中医药大学病理生理研究中心，福建 福州 350）

异补骨脂素对氧化损伤的HLEC线粒体超微结构的影响

冯春燕1，陈胜1，胡艳红1，柯发杰1，胡俊1，黄秀榕2，祁明信1
（1.福建中医药大学附属第二人民医院，福建 福州 350003；
2.福建中医药大学病理生理研究中心，福建 福州 350122）

目的观察异补骨脂素对氧化损伤的HLEC线粒体超微结构的影响。方法实验分正常对照组、H2O2组、E2组、ISR组，密度梯度离心法分离出HLEC线粒体，透射电镜观察HLEC线粒体超微结构。结果正常对照组线粒体双层膜结构完整，嵴结构完整，线粒体几乎未受损伤；H2O2组线粒体双层膜结构不完整，嵴结构断裂消失，线粒体受损伤；E2组、ISR组线粒体双层膜结构稍完整，嵴结构断裂，线粒体受损伤，但较H2O2组情况好。结论异补骨脂素对H2O2诱导氧化损伤的HLEC线粒体超微结构有保护作用。

异补骨脂素；氧化损伤；人晶状体上皮细胞；线粒体

异补骨脂素（isopsoralen，ISR）是从补骨脂中提取的有效单体，我们课题组前期研究［1-4］发现ISR和雌二醇（β-Estradiol，E2）一样具有雌激素作用，能够增强抗氧化能力，提高人晶状体上皮细胞（human lens epithelia cell，HLEC）内抗氧化酶超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-px）和过氧化氢酶（catalase，CAT）活性；提高 HLEC内 SOD mRNA、GSH-px mRNA、CAT mRNA的表达，减轻HLEC氧化损伤，对H2O2诱导氧化损伤的HLEC发挥保护作用。本实验进一步分离HLEC线粒体，用透射电镜观察HLEC线粒体超微结构，探讨ISR保护氧化损伤的HLEC亚细胞水平的形态结构变化。

1材料与方法

1.1材料3%戊二醛、1.5%多聚甲醛、0.1mol/L磷酸缓冲液、1%锇酸亚铁-1.5%氰化钾混合液、醋酸铀、柠檬酸铅、MTT干粉（美国Sigma公司）；Mitochondria Isolation Kit for Cultured Cells（鹭隆生物科技有限公司）；异补骨脂素（中国药品生物制品检定所，纯度99.5%）；E2（美国Sigma公司，纯度97%）；二甲基亚砜（美国Amresco公司）；乙二胺四乙酸（美国Augus公司）；胰蛋白酶、DMEM培养基干粉（美国Gibco公司）；新生小牛血清 （奥地利Paa公司），H-7650电子显微镜（日本日立公司）；UC-6超薄切片机（美国LaiCa公司）；常温离心机、低温离心机（德国Heraeus Inc.公司）；-80℃低温冰箱（英国New Brunswick Scientific Inc.公司）；IMT-413倒置相差显微镜（日本Olympus公司）、CO2培养箱（美国Forma公司）；超净工作台（江苏SW-CJ-IF）。

1.2HLEC培养及传代采用永生化人晶状体上皮细胞系HLE-B3。取出冻存管中的HLE-B3立即放入37℃水中，将溶解的细胞悬液用10倍体积以上的培养液进行稀释，离心，去上清，反复洗涤3次。以5×105个/mL接种于培养瓶中，37℃、5%CO2培养箱培养。待细胞生长融合后，进行传代培养用于实验。

1.3实验分组① 正常组：HLEC加 DMEM培养液；② H2O2组：正常组加H2O2（终浓度300 μmol/ L）；③ E2组：H2O2组加E2（终浓度10-2μmol/L）；④ISR组：H2O2组加ISR（终浓度10 μmol/L）。

1.4细胞线粒体分离①收集2×107细胞于2 mL微量离心管，离心850×g，2 min，弃上清；② 加800 μL线粒体分离试剂A于离心管，以中等速度漩涡5 s，冰上孵育2 min；③ 将细胞悬液转于冰冷的杜恩斯组织研磨器，充分匀浆细胞；④ 将匀浆液移到原离心管中，加800 μL线粒体分离试剂C，200 μL线粒体分离试剂A，混匀，离心700×g，10 min，4℃；⑤ 转上清液于一新离心管，离心3 000× g，15 min，4℃；⑥转上清液于一新离心管，加500 μL线粒体分离试剂C，离心12 000×g，5 min，4℃弃上清，所得沉淀即为线粒体。

1.5透射电镜观察HLEC线粒体超微结构① 前固定：分离出的HLEC线粒体以3%戊二醛-1.5%多聚甲醛混合液-0.1M PBS（pH 7.2）4℃过夜；② 漂洗：0.1M PBS（pH 7.2）3次；③后固定：1%锇酸-1.5%亚铁氰化钾4℃ 1.5 h；④ 漂洗：0.1M PBS（pH 7.2）3次；⑤ 脱水：50%酒精10 min→70%酒精饱和醋酸铀染液4℃过夜→90%酒精10 min→90%酒精-丙酮10 min→90%丙酮10 min→无水丙酮10 min×3次；⑥ 浸透：无水丙酮+环氧树脂618包埋剂（1∶1）1.5 h，纯618包埋剂 35℃3 h；⑦ 包埋、聚合：35℃12 h、45℃ 12 h、60℃ 3 d；⑧切片、染色：超薄切片机切70～80 nm的超薄切片；经醋酸铀、柠檬酸铅分别染色5 min，并蒸馏水水洗；⑨ 透射电镜下观察并摄片。

2结果

2.1线粒体分离纯化质量鉴定各组HLEC线粒体电镜观察显示：线粒体聚集，其它细胞结构基本未见，说明线粒体分离纯化良好。

2.2ISR对氧化损伤的HLEC内线粒体超微结构的影响① 正常对照组：线粒体双层膜结构完整，嵴结构完整，线粒体几乎未受损伤，见图1。②H2O2组：线粒体双层膜结构不完整，嵴结构断裂消失，线粒体受损伤，见图2。③E2组：线粒体双层膜结构稍完整，嵴结构断裂，线粒体受损伤，但较H2O2组情况好，见图3。④ ISR组：线粒体双层膜结构稍完整，嵴结构断裂，线粒体受损伤，但较H2O2组情况好，见图4。

3讨论

3.1文献［5］表明，白内障的发病率呈男女性别差异，女性高于男性，且绝经后表现更为明显。Krishnaiah等［6］发现绝经后接受激素替代治疗的女性白内障患病率明显低于未使用者及同龄男性，激素替代治疗对皮质性、核性、后囊下性白内障有保护作用［7］。研究发现白内障的发生与缺乏雌激素的保护有关［8］，雌激素能够减轻晶状体氧化损伤程度［9-10］，抑制HLEC凋亡，在白内障的发生发展过程中起一定的作用。

3.2ISR是从补骨脂中提取的有效单体，我们前期研究发现ISR和E2发挥相同的作用，具有雌激素样活性，能够增强抗氧化能力，提高HLEC内抗氧化酶SOD、GSH-px、CAT活性，提高HLEC内的SODmRNA、GSH-pxmRNA、CATmRNA的表达，减轻HLEC氧化损伤，从而对氧化损伤的HLEC发挥保护作用。线粒体是一种真核细胞中普遍存在的细胞器，是细胞内氧化磷酸化及形成ATP的主要场所，故有细胞“动力工厂”之称。目前纯化线粒体的方法主要是差速离心结合密度梯度离心。密度梯度介质一般采用Percoll密度梯度和蔗糖密度梯度，提取的线粒体都需要进行纯度评价。纯度评价一般从3个方面进行：形态学观察、特异酶活性测定、特异抗体检测，形态学观察一般采用透射电镜来进行。本实验通过密度梯度离心法分离出HLEC线粒体，并通

过透射电镜鉴定，发现各组线粒体聚集，其它细胞结构基本未见，分离纯化良好。可见密度梯度离心法是分离出HLEC线粒体的有效方法。

3.3实验结果示：正常对照组线粒体双层膜结构完整，嵴结构完整，线粒体几乎未受损伤。经H2O2诱导氧化损伤后，HLEC的线粒体形态发生改变，线粒体双层膜结构不完整，嵴结构断裂消失；E2在保护 H2O2诱导氧化损伤 HLEC的同时，也保护了HLEC线粒体的形态结构。ISR和E2一样在保护H2O2诱导氧化损伤HLEC的同时，也保护了HLEC线粒体的形态结构，说明ISR对H2O2诱导氧化损伤的HLEC线粒体超微结构有保护作用。

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R776

B

1000-338X（2016）03-0018-02

2016-03-02

福建省自然科学基金资助课题（2014J05093），福建省创新课题（2014-CXB-21）

冯春燕（1979—），女，医学博士，主治医师，主要从事白内障的基础与临床研究。

祁明信（1945—），男，教授，主任医师。E-mail：qihuang@ netease.com