环介导等温扩增 （LAMP）技术及其在猪繁殖障碍性疾病病原检测中的应用

于新友　李天芝

环介导等温扩增 （LAMP）技术及其在猪繁殖障碍性疾病病原检测中的应用

于新友李天芝

（山东绿都生物科技有限公司，山东滨州 256600）

环介导等温扩增 （LAMP）技术是一门新兴的分子生物学检测技术，因其具有特异性强、灵敏度高、快速、准确、操作简便和成本低等特点，越来越受到兽医相关工作者的关注。目前，该方法己被广泛应用于各种猪病病原的检测。本文对LAMP技术及其在猪繁殖障碍性疾病病原检测中的应用研究进展进行综述，以期为今后猪繁殖障碍性疾病的诊断和防控工作提供参考。

LAMP；猪繁殖障碍性疾病；病原；检测；应用

猪繁殖障碍性疾病是指繁殖期内公、母猪由于疾病因素引起的，以妊娠母猪流产，产死胎、木乃伊胎、弱仔、畸形仔，少仔和公母猪不育症为主要特征的一类疾病总称。近年来，猪的繁殖障碍性疾病问题十分突出，严重影响养猪业的健康发展。引起猪繁殖障碍性疾病的病原主要是病毒、细菌和寄生虫。病毒主要包括猪瘟病毒（CSFV）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪圆环病毒2型（PCV2）、猪乙型脑炎病毒（JEV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪细小病毒（PPV）、猪脑心肌炎病毒等。细菌单独引起的猪繁殖障碍性疾病发生较少，主要由布鲁氏杆菌、链球菌、金黄色葡萄球菌、李氏杆菌、钩端螺旋体、大肠杆菌、绿脓杆菌、猪丹毒杆菌等感染引起，主要引起散发性流产、死胎、子宫内膜炎、乳房炎、阴道炎等。寄生虫主要包括弓形虫、附红细胞体、猪冠尾线虫等。猪繁殖障碍性疾病常由两种以上的病原体共同作用或继发感染造成，这增加了疾病诊断与防控的难度，给养猪业造成巨大的经济损失。目前，养殖场主要是将病料送专业检测实验室进行病原分离鉴定或PCR检测，一旦出现疫情，由于条件所限，很难实现对疫病的快速检测。日本学者Notomi等［1］开发了一种环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）扩增核酸的技术，该技术不需要模板的热变性［2］、长时间温度循环、繁琐的电泳和紫外观察等过程，整个反应在恒温条件下进行，反应结束后，结果可用肉眼直接观察，在疫病诊断领域显示了广阔的应用前景。本文就LAMP技术及在猪繁殖障碍性疾病检测中的应用研究进展综述如下。

1 LAMP技术

LAMP技术是针对靶基因6个区域设计4条特殊引物，利用具有链置换活性的BstDNA聚合酶，在65℃左右温度下，启动循环链置换反应，完成对目标DNA的大量扩增，扩增产物为花椰菜结构的茎-环DNA混合物。

1.2 LAMP引物设计

首先在靶基因的5’末端和3’末端分别设定B1、B2、B3和F3c、F2c、F1c等区段。针对这六个区段设计四条引物，包括一对内部引物和一对外部引物。上游内部引物FIP：在3’末端含有与F2c互补的F2区段，在5’末端含有与F1c相同序列的区段。下游内部引物BIP：在3’末端含有与B2c互补的B2区段，在5’末端含有与B1c相同序列的区段。上游外部引物F3：含有与目标DNA上的F3序列相同的区段。下游外部引物B3：含有与目标DNA的B3相同序列的区段，各引物组成及对应区域如图1所示。引物的设计要注意以下几个问题：①扩增领域为F2-B2区段间，该片段长度最好小于200 bp。②包含F2/B2在内的各环状部分的长度在40～60 bp范围内。③Tm值处于60～65℃之间。④若只是为了鉴定靶基因存在与否，F1-B1的间距可以为零。⑤引物应避免二次结构发生。⑥各引物的3’端不可含有与其他引物互补的序列。

图1　LAMP的引物组成及对应区域

1.3 LAMP技术特点

LAMP技术具有以下特点：①操作简便、耗时短、成本低，在恒温条件先完成扩增反应，不需要特殊试剂，不需要提前对双链DNA变性，适合在基层养殖场的推广应用。②扩增的效率高，没有PCR反应中模板的退火、复性过程，在15～60分钟内可扩增109～1010倍，能满足临床病料样本快速检测的需要。③特异性高，6个区域中任何区域与引物序列不匹配均不能扩增核酸。④灵敏度高，检测的敏感性是常规PCR的10倍，扩增模板可达10拷贝或更少。⑤仅使用一种链置换型BstDNA聚合酶，但BstDNA聚合酶必须在模板预变性以后再加入。⑥扩增产物是在同一条DNA链上互补序列周而复始形成大小不一的结构。⑦对RNA模板样品，只需加入逆转录酶就能像DNA模板样品一样进行扩增反应。

1.4反应产物的检测

LAMP反应产物的检测方法主要有五种：①以2%的琼脂糖凝胶电泳观察是否有典型的梯状条带判定结果。②用肉眼观察扩增产生的副产物—焦磷酸镁白色沉淀的产生以直接判断扩增反应是否进行。③反应体系中加入溴化乙锭、SYBR GreenⅠ等染料，通过观察扩增结果是否产生相应颜色来判定是否有目的片段扩增。④通过恒温扩增微流控芯片实时观察反应结果。⑤运用实时浊度仪监测反应结果。

4) 2017年12月19日，通过诊断系统发现化工部供中沙(天津)石化公司抽余油流量计密度由680 kg/m3增到730 kg/m3，系统连续报警“驱动增益超出量程”、“左检测线圈超限错误”，同时与下游表比对出现0.3%允差指标，最大时达到0.74%。经拆检发现流量计出现严重挂壁，经清洗后恢复正常。

2病毒类繁殖障碍性疾病病原检测

2.1猪瘟病毒检测

由CSFV引起的猪瘟是一种猪的急性、热性、高度接触性传染病，该病对养猪业危害极大，且流行广泛［3］，临床上亚临床感染和隐性感染增多，妊娠母猪带毒综合征病例突出，感染种猪外表健康，却是猪瘟流行最危险的传染源。感染母猪所产仔猪伴随高死亡率、弱仔、神经症状等。张改平等［4］建立了CSFV的LAMP检测方法，可区分猪瘟强毒和疫苗毒，检测敏感性高，是常规RT-PCR的1 000倍，特异性好，对其他猪常发病原核酸无扩增，进一步验证显示，该法同时有很好的重复性和特异性。郑新添等［5］针对CSFV的NS3基因设计LAMP引物，建立了快速检测CSFV的LAMP方法，并对LAMP反应体系、反应条件进行优化，评定其特异性和敏感性。结果表明：该方法可在65℃50分钟内快速扩增CSFV，扩增结果可通过可视的颜色判断，LAMP反应对PRV、PCV2、PRRSV等无交叉反应，其检测CSFV的最低浓度为13.6 fg/μL，对临床样品的检出率高于RT-PCR技术。

2.2猪繁殖与呼吸综合征病毒检测

PRRSV引起的母猪繁殖障碍主要表现为流产、产死胎、弱胎、木乃伊胎，特别是妊娠母猪的后期流产，流产率可达30%以上，小猪的死亡率在35%～40%之间。传播途径很多，包括口腔、鼻腔、肌肉及生殖道。蒲静等［6］针对PRRSV美洲型ORF6基因的6个区域，利用2对引物建立检测PRRSV的RT-LAMP快速检测方法，该方法具有高灵敏度、高特异性的优点，在2小时左右即可得出结果，其灵敏度与PRRSV荧光RT-PCR检测方法相近，高于普通RT-PCR检测方法。将灭活的PRRSV美洲型培养物作10倍系列稀释，结果显示建立的荧光RT-PCR的检测极限可达10-7，RT-PCR检测方法的检测极限为10-5，RT-LAMP检测方法达到10-8。罗忠永等［7］根据PRRSV M蛋白基因保守区设计的LAMP引物，建立了PRRSV的快速检测方法，结果表明，该法能在64.5℃60分钟内实现对目标核酸片段的大量扩增，检测结果可通过直接观察反应副产物—焦磷酸镁进行判读，该检测系统具有很高的特异性，与CSFV、JEV等均无交叉反应，通过PRRSV不同毒株疫苗、模拟样品和临床样品确定，该检测系统具有很好的稳定性，通过质粒确定该检测系统可以检测到10拷贝/μL的病毒核酸模板。

2.3猪伪狂犬病毒检测

PRV可引起猪的伪狂犬病，各种日龄猪均可发病，初生仔猪可表现为神经症状和腹泻，死亡率高达100%，怀孕母猪可表现为流产、死胎、弱胎和木乃伊胎等。张莉等［8］根据PRV gE基因区域设计4条引物，建立了PRV的LAMP检测方法，该法最低可检测100个拷贝质粒DNA量，对PRV强毒的检测有很好的特异性，对PRRSV、PPV、CSFV、猪流感病毒和PRV gE基因缺失疫苗基因组扩增结果均为阴性。王树芬等［9］将罗丹明B衍生物作指示剂在反应前加到反应缓冲液里，通过优化反应条件，建立LAMP快速检测PRV的方法，该法在63℃40分钟即可完成全部扩增反应，肉眼观察就能判定反应结果，扩增产物颜色为蓝色时判定为阳性，为紫色时判定为阴性。

2.4猪圆环病毒2型检测

PCV2是引起仔猪断奶后多系统衰竭综合征的主要病原，还可以引起母猪的繁殖障碍，同时也是一种免疫抑制性疾病，常与其他疾病发生混合感染。杨泽晓等［10］建立了LAMP检测PCV2的方法，64℃45分钟即可完成扩增反应，电泳检测扩增产物为大于1 345 bp的梯状条带。该法特异性好，对PCV1、PPV、PRV、PRRSV 和CSFV核酸结果均为阴性。敏感性高，对模板DNA检测量为10拷贝/μL，通过对60份临床检样符合性检测试验结果显示，该法检测结果与PCR完全一致。胡瑞丽等［11］根据PCV2的ORF2基因设计出3对特异性引物，扩增PCV2基因的最佳温度和时间优化到59℃孵育55分钟。用该方法对临床样品进行检测，LAMP检测对PCV2的检测限为10拷贝/μL，而常规PCR检测法的检测限为1 000拷贝/μL，表明LAMP检测法灵敏度高。该检测法不会与PCV1、PRRSV、猪流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒和轮状病毒发生交叉反应。

2.5猪细小病毒检测

PPV可引起母猪发生流产、产死胎、产畸形胎、胎儿木乃伊化和不孕等，母猪本身没有症状，初产母猪受到的危害最为严重。刘业兵等［12］建立了PPV的LAMP检测方法，63℃45分钟可完成检测反应。敏感性高，最低可检测0.23 TCID50病毒量，特异性好，对其他病毒核酸无扩增反应，在反应产物内加入SYBR Green I肉眼判断结果，与Real Time Turbidimeter LA-320仪监测结果一致。陈星瑶等［13］建立了快速检测PPV的LAMP方法，通过优化反应条件，扩增的温度60℃、62℃、64℃和66℃均可以，最佳扩增时间为45分钟，最低可检测10拷贝的PPV核酸模板量，特异性良好，对SS2、猪水泡病病毒、PRV、CSFV、猪流感病毒、O型口蹄疫病毒、PRRSV核酸扩增结果均为阴性，在反应产物内加入SYBR GreenⅠ荧光染料，通过肉眼观察结果，当反应产物颜色变为黄绿色，判为阳性，否则为阴性。

2.6猪乙型脑炎病毒检测

乙脑是由JEV引起的一种人畜共患的自然疫源性传染病，JEV主要通过蚊虫叮咬传播，猪是其主要传染来源和扩散宿主，可导致妊娠母猪流产、产死胎或弱仔，公猪睾丸炎，育肥猪持续高热，新生仔猪呈神经症状等。卢冰霞等［14］根据猪JEV E基因序列的保守区6个位点设计了4条特异性LAMP引物，以JEV阳性样品RNA为模板进行一步法扩增，并对反应条件和反应体系进行了优化。结果表明，该方法具有较高的灵敏度，其检测极限为0.5 pg，特异性试验表明其具有较高的特异性，对其他病毒性病原体均无扩增反应。与RT-Nested-PCR相比，两种方法检出率的符合率为90.9%。反应结束后可以通过添加化学发光剂进行可视化观察，大大缩短了检测时间。周玉鹏等［15］根据Gen Bank中登录的基因Ⅰ型和基因Ⅲ型JEV毒株基因序列，分别设计了1套基因Ⅰ型和基因Ⅲ型特异性RT-LAMP引物，并以此引物分别建立了基因Ⅰ型和基因Ⅲ型特异性RT-LAMP方法。结果显示，基因Ⅰ型和基因Ⅲ型特异性RT-LAMP方法均能在1小时内完成对相应基因型JEV RNA的扩增，并与CSFV、PRRSV、PCV2、PPV和PRV无交叉反应。灵敏性试验结果显示，基因Ⅰ型和基因Ⅲ型JEV特异性RT-LAMP方法均能扩增出24拷贝数的JEV RNA。

2.7猪脑心肌炎病毒检测

猪脑心肌炎病毒感染可导致猪脑心肌炎，感染母猪临床表现主要为流产、产死胎、弱胎、木乃伊胎。仔猪主要表现为心肌炎，死亡率可达100%。张岭岭等［16］针对EMCV 3D基因保守序列的6个特异性部位设计了2对引物，利用Bst DNA聚合酶，63℃恒温保持50分钟即可完成反转录与扩增反应，产物中加入SYBR GreenⅠ染料，在紫外光下可直接观察判定扩增结果，试验成功建立了猪脑心肌炎病毒的RT-LAMP检测方法。结果表明，该方法灵敏度比RT-PCR高100倍，具有良好的重复性和稳定性，而且对其他病毒均无扩增结果，可作为猪脑心肌炎病毒的快速诊断方法。

3细菌类繁殖障碍性疾病病原检测

3.1猪布鲁氏杆菌检测

布鲁氏杆菌病是由布鲁氏菌引起的世界五大人畜共患传染病之一，不同品种和年龄的猪均易感，感染母猪可表现为流产、不孕、阴唇红肿、阴道流出脓性分泌物，公猪主要表现为睾丸炎。许邹亮等［17］针对布鲁氏菌外膜蛋白OMP25基因设计引物，建立了布鲁氏菌LAMP检测方法，该法在反应前加入染料羟基萘芬蓝（HNB）作为LAMP扩增的指示剂，63℃恒温反应60分钟，根据HNB的颜色变化进行结果判定。结果显示，该法最低检出限约为17 fg布鲁氏菌基因组DNA。特异性良好，猪大肠杆菌K99、巴氏杆菌C48-1、猪链球菌ST171、绿脓杆菌等对照组均未出现扩增。

3.2猪金黄色葡萄球菌检测

金黄色葡萄球菌感染可造成猪的急性、亚急性或慢性乳腺炎，坏死性葡萄球菌皮炎及乳房的脓疱病。蔡克周等［18］建立了猪金黄色葡萄球菌LAMP检测方法，该法主要针对其femA基因设计引物，在水浴锅中63℃30分钟即可完成扩增反应，最终通过琼脂糖凝胶电泳判定反应结果，对金黄色葡萄球菌的灵敏度为8.7 CFU/mL，高于常规PCR检测方法，且有很好的特异性，对其他病原物扩增反应。

3.3猪链球菌血清2型检测

猪链球菌是一种重要的人兽共患病病原菌，各年龄段猪均可感染猪链球菌病。临床主要表现为败血症、关节炎、脑膜炎等，也可导致怀孕母猪流产。

除病猪外，康复猪和健康猪也可带菌，当它们互相接触，可通过口、鼻、皮肤伤口而传染。自然感染的部位是上呼吸道、消化道和伤口。张九州等［19］根据猪链球菌2型荚膜多糖基因保守区域，设计LAMP引物，建立了猪链球菌2型LAMP检测方法，结果显示，该法敏感性高，最低可检测链球菌基因组DNA的量为0.186 fg/μL，是常规PCR的1 000倍，对其他细菌扩增结果均为阴性，具有良好的特异性。

4寄生虫类繁殖障碍性疾病病原检测

弓形虫引起的母猪繁殖障碍表现为高热、食欲废绝、昏睡、持续3～5天后发生流产或产出死胎、畸形胎。一旦流产后母猪即可解除高热昏睡状态。王玉娇等［20］建立了猪弓形虫病LAMP检测方法，结果显示，该法在样本DNA稀释3×105倍后仍可检出，该方法扩增不出新孢子虫、瑟氏泰勒虫及猪附红细胞体等病原体DNA，表明建立的LAMP方法具有灵敏、特异、快速等优点，适合于猪弓形虫病的检测。猪附红细胞体可引起猪的附红细胞体病，该病临床表现为发热、黄疸和贫血，感染母猪也可出现繁殖障碍性疾病，主要表现为发情不正常、受胎率不高、产弱胎和死胎等。李月梅等［21］建立了用LAMP技术检测猪附红细胞体的方法，并对该法检测的特异性和敏感性进行了验证，结果表明，该法特异性好，对瑟氏泰勒虫、新孢子虫和弓形虫核酸均无扩增反应，敏感性高，最低可检测5×105倍稀释的附红细胞体DNA量，可用于临床样品的快速检测。

5小结与展望

LAMP技术作为一种快速基因扩增技术，自发明以来，在国内外疾病、卫生、食品及环境等多个领域都取得了重大成就，近年来受到了越来越多的关注，LAMP是整个过程均在恒温条件下进行、不需要昂贵仪器设备而易在基层部门普及的检测技术，避免了常规PCR对于温度循环的特殊要求所带来的各种不便，可快速诊断疾病，从而采取措施，降低养殖场损失。但LAMP检测技术同样存在一些不足：一是LAMP对于引物设计要求很高，需要设计的引物数目多，结构复杂。二是检测灵敏度太高，易因空气中的气溶胶污染而产生假阳性结果。三是在LAMP扩增结果判定方面也存在一定的问题，当以琼脂糖凝胶电泳法判定结果时，结果为梯形条带，不易鉴别非特异性扩增。当以焦磷酸镁白色沉淀和体系中添加染料法判定结果时，可能存在因结果颜色不明显而造成肉眼观察不便捷及误判；另外，当有非特异扩增时，染料也可结合，影响结果判定。当以微流控芯片和实时浊度仪法判定结果时，则需要购置昂贵的分析仪器。随着研究的不断深入，研究人员还将其与原位杂交、免疫捕获、核酸杂交等技术进行联合，开发了很多有效的检测方法，尤其是，发展起来的新的将环介导等温扩增技术（LAMP）与横向流动试纸条（LFD）联合应用，建立一种新的病原快速检测技术，即LAMP-LFD技术，使得LAMP现场检测结果的观察更加方便、直观和准确，并解决了扩增产物形成气溶胶污染环境，导致样品间交叉污染的问题，开启了基因检测技术步入基层养殖场的应用新时代，极具推广前景。目前已经有科研人员在CSFV的检测方面进行了一些探索，并取得了一定的成绩。笔者认为LAMP-LFD技术是未来LAMP检测技术发展的方向，在一些基层实验室和流行病学调查等领域具有广阔的应用前景。

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S858.28

A

1673-4645（2016）07-0050-05

2016-06-03

山东省现代农业产业技术体系生猪产业创新团队项目（SDAIT-06-022-15）；山东省自然科学基金（ZR2013CQ006）；山东省自然科学基金项目（ZR2014CQ010）

于新友（1983-），男，汉族，执业兽医师，主要从事动物传染病诊断技术研究，E-mail：yuxinyou_2006@126.com