抗菌肽IB-367的固相合成与抑菌活性

王小青, 高　杨, 尹志峰, 宫闻婧, 赵红玲, 王良友*

(1. 承德医学院 河北省中药研究与开发重点实验室，河北 承德　067000；2. 承德天创生物制品有限公司，河北 承德　067000)



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抗菌肽IB-367的固相合成与抑菌活性

王小青1, 高杨1, 尹志峰1, 宫闻婧2, 赵红玲1, 王良友1*

(1. 承德医学院 河北省中药研究与开发重点实验室，河北 承德067000；2. 承德天创生物制品有限公司，河北 承德067000)

摘要：采用固相合成方法，以Rink Amide树脂为载体，Fmoc保护氨基酸为原料，经苯并三唑-1-四甲基六氟磷酸酯(HBTU)/N,N-二异丙基乙胺(DIEA)缩合，三氟乙酸/苯甲硫醚/乙二硫醇/苯甲醚裂解体系脱除保护基制得IB-367线性肽(4)； 4经双氧水氧化制得IB-367一环肽(5)； 5经碘乙醇溶液氧化合成抗菌肽IB-367(6)，收率34.1%，纯度>95.0%，其结构经MS(ESI)和氨基酸组成分析确证。抑菌活性研究结果表明：6对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为5.0 μg·mL-1。

关键词：依色格南; 固相合成; 二硫键; 抑菌活性

依色格南(IB-367)为含有4个Cys残基的抗菌活性17肽(Chart 1)，是猪中性粒细胞肽-1(PG-1)的类似物[1]，能与细菌的胞外成分如脂多糖或脂膜酸等结合，引起细菌膨胀、破裂，通过破坏细胞膜杀死细菌[2-5]，其抗菌谱广泛，对革兰氏阳性、阴性细菌及真菌、酵母菌等均有抑制作用，且耐药性较低[6]。有关IB-367的合成法，目前主要有片段缩合法、固相合成法和基因工程法[7-8]等。其中基因工程方法纯化困难，难以得到纯品，尚未形成一种适用于工业化生产的方法；片段缩合法会增加反应步骤和处理难度，降低产物的合成效率；全固相合成法因无法控制反应停止时间，成本过高，产率不稳定无法进行工业化生产。

Chart 1

Scheme 1

本文采用固相合成与液相环化相结合的方法，首先采用固相合成方法，以Rink Amide Resin为载体，Fmoc保护氨基酸为原料，经苯并三唑-1-四甲基六氟磷酸酯(HBTU)/N,N-二异丙基乙胺(DIEA)缩合， 三氟乙酸/苯甲硫醚/乙二硫醇/苯甲醚裂解体系脱除保护基制得7,12-位带Acm保护基的IB-367线性肽(4)； 4在液相中以双氧水环化Cys5-Cys14制得IB-367一环肽(5)； 5通过碘的乙醇溶液脱掉Acm保护基同时环化Cys7-Cys12合成IB-367(6， Scheme 1)，收率34.1%，纯度>95.0%，其结构经MS(ESI)和氨基酸组成分析确证。并对其抑菌活性进行了研究。

1实验部分

1.1仪器与试剂

Agilent Technologies 1200型高效液相色谱仪(UV检测器)；Newstyle型反相高效制备液相色谱仪；Hedera 50型半制备液相色谱仪[ODS-2反相硅胶柱(10 mm×250 mm， 10 μm)，检测波长:215 nm；流动相：乙腈/0.1%TFA水溶液，流速5 mL·min-1，乙腈26%～40%，洗脱时间30 min]； SPH-100B型小容量恒温培养振荡器。

大肠杆菌L与Z(分离自医院感染科)，金黄色葡萄球菌26001-26，白葡萄球菌26069-5， LB培养基和营养肉汤，北京奥博星生物技术有限公司；Rink 树脂(替代度为0.5 mmol·g-1)，天津南开合成科技有限公司；Fmoc保护氨基酸，成都诚诺新技术有限公司；乙腈，色谱纯，天津永大化学试剂有限公司；其余所用试剂均为分析纯。

1.2合成

(1) NH2-Rink-Resin(1)的合成

在反应柱中加入Rink树脂1.977 g(0.5 mmol·g-1)和DMF 20 mL，通氮气溶涨30 min，用DMF洗涤，加入20%哌啶的DMF(20 mL)溶液，反应20 min，用茚三酮检测合格后，用DMF洗涤得1。

(2) Fmoc-Arg(pbf)-Rink Resin(2)的合成

在1中加入Fmoc-Arg(pbf)-OH 1.301 g(2 mmol)， HBTU 0.927 g(1 mmol)和DIEA 0.7 mL(2 mmol)，通氮气反应1.5 h，用DMF洗涤，加入醋酸酐与吡啶(V/V=6/5)混合液40 mL，反应14 h。加甲醇(20 mL)收缩2次(10 min/次)，减压干燥至恒重得2 2.421 g，替代度0.323 mmol·g-1。

(3) IB-367-Rink Resin(3)的合成

将2置反应柱中，加入DMF 20 mL，充分溶涨并洗涤后，加20%哌啶的DMF(20 mL)溶液，反应20 min，茚三酮检测合格后，洗涤并抽干。根据IB-367的氨基酸序列用按1.2(2)方法自C端向N端依次在2上依次连接Fmoc-Gly-OH， Fmoc-Val-OH， Fmoc-Cys(Trt)-OH， Fmoc-Val-OH， Fmoc-Cys(Acm)-OH， Fmoc-Phe-OH， Fmoc-Arg(pbf)-OH， Fmoc-Gly-OH， Fmoc-Arg(pbf)-OH， Fmoc-Cys(Acm)-OH， Fmoc-Tyr(tBu)-OH， Fmoc-Cys(Trt)-OH， Fmoc-Leu-OH， Fmoc-Gly-OH， Fmoc-Gly-OH和Fmoc-Arg(pbf)-OH，用甲醇收缩，减压干燥至恒重得3 4.007 g。

(4) 4的合成

将3置烧瓶中，加入裂解液[V(TFA) ∶V(苯甲硫醚) ∶V(EDT) ∶V(苯甲醚)=90 ∶5 ∶3 ∶2]40 mL，冰浴冷却30 min，于室温反应2 h。过滤，滤液倾入无水冰乙醚(400 mL)中(析出白色沉淀)，4000 r·min-1离心4 min，沉淀真空干燥至恒重。用无氧水溶解，经半制备RP-HPLC纯化，冻干得白色固体4 1.035 g； MS(ESI)m/z： 512.1[M+4H]4+。

4经酸水解(6 mol·L-1盐酸水溶液，于110 ℃反应22 h，方法下同)的氨基酸组成实测值与理论值(括号内，下同)相符：Arg 4.09(4)， Gly 4.21(4)， Leu 0.98(1)， Gys 4.11(4)， Tyr 1.07(1)， Phe 0.96(1)， Val 1.92(2)。

(5) 5的合成[9]

将4 1.035 g溶于1 L水中，搅拌使其溶解，配制1 mg·mL-1溶液，用饱和碳酸氢钠溶液调至pH 7.2，加双氧水100 mL，环化反应20 min(HPLC监测)。用冰醋酸调至pH 3.0，按1.2(4)制得白色固体5 0.724 g； MS(ESI)m/z： 511.9[M+4H]4+， 682.5 [M+3H]3+， 1022.9 [M+2H]2+；经酸水解的氨基酸组成实测值与理论值相符：Arg 4.14(4)， Gly 4.12(4)， Leu 1.16(1)， Gys 3.89(4)， Tyr 1.15(1)， Phe 1.11(1)， Val 2.10(2)。

(6) 6的合成

取5 0.724 g配制成1 mg·mL-1水溶液，用冰醋酸调至pH 3.0，搅拌下缓慢滴加20 mg·mL-1碘乙醇至溶液颜色稳定为黄色，环化反应1 h(HPLC监测)，按1.2(4)制得白色固体6 0.419 g； MALDI-TOF-MSm/z： 1 901.389[M+H]+；经酸水解的氨基酸组成实测值与理论值相符： Arg 3.97(4)， Gly 4.01(4)， Leu 1.05(1)， Gys 4. 07(4)， Tyr 1.13(1)， Phe 0. 88(1)， Val 2.00(2)。

1.3抑菌活性测定

(1) 最小抑菌浓度(MIC)实验[10]

精密称取6 2.0 mg于4 mL离心管，用无菌水溶解，制备成1.0 mg·mL-1的供试品溶液，并稀释为0.5， 0.25， 0.125， 0.1， 0.05和0.025 mg·mL-1系列浓度。在无菌操作状态下，将金黄色葡萄球菌26001-26，白葡萄球菌26069-5，大肠杆菌临床菌L与Z， 4种菌接种于LB平板中，培养24 h活化菌株，挑取单克隆菌株转移至液体培养基培养15 h，用分光光度计测量其OD值(600 nm)，并稀释使其菌悬液OD值为0.2左右，即菌液浓度约为2×1011cfu·mL-1。取10 μL 6供试品溶液，10 μL菌液，80 μL液体培养基于96孔板，无菌水代替供试品溶液作为阴性对照(CK)。培养8 h后观察长菌情况。

(2) 抑菌圈实验[11]

取无菌并干燥的滤纸片(Φ=6 mm)，每片精密滴加1 mg·mL-16 20 μL，置清洁无菌平皿内，无菌操作台干燥后备用。取无菌干燥滤纸片，每片滴加无菌蒸馏水20 μL，制备成阴性对照样片。将指示细菌菌液(约1×108cfu·mL-1)涂布于LB 平板，在适当位置贴上己灭菌的滤纸片，于37 ℃培养16～24 h，用游标卡尺测量抑菌环的直径(包括贴片)并记录，试验重复3次。

2结果与讨论

2.1合成

在固相合成中，载体对合成影响较大，本研究比较了Rink Amide Resin，Rink Amide AM Resin与Rink Amide MBHA Resin 3种树脂，结果显示不同载体对IB-367的合成影响不大，本研究最终选择价格相对较低的Rink Amide Resin为固相载体；Rink-Amide-Am-Resin接第一个氨基酸时替代度的大小对后面16个氨基酸的偶联非常重要，其原始替代度为0.5 mmol·g-1，连接Fmoc-Arg(pbf)-OH理论100%连接替代度为0.378 mmol·g-1，替代度选用较高的0.323 mmol·g-1，可以提高收率，降低成本。IB-367含17个氨基酸，每个氨基酸与上一个氨基酸偶联程度对合成后粗肽的纯率有很大的影响，比较了DIC/HOBt，HBTU/DIEA与HBTU/HOBt/DIEA 3种缩合体系，最终选择合成效率最高且副产物少的HBTU/HOBt/DIEA为缩合剂；比较1 ∶4， 1 ∶3与1 ∶2等投料比，结合实际生产，考虑合成成本和合成效率最终选择1 ∶3为投料比。

固相合成中切割反应在各种酸条件下完成，一般不同的树脂需要不同的切割试剂，同一树脂也因肽侧链保护基不同而需要不同的试剂配方，以减少副反应，提高纯度。本文比较了TFA(100)， TFA ∶H2O(95∶5)， TFA ∶苯甲硫醚 ∶EDT ∶苯甲醚(90 ∶5 ∶3 ∶2)， TFA ∶TIS ∶H2O (95 ∶2.5 ∶2.5)， TFA ∶苯甲硫醚 ∶EDT ∶TIS(90 ∶5 ∶3 ∶2)与TFA ∶苯甲硫醚 ∶间甲酚 ∶EDT(91 ∶5 ∶1 ∶3)等6种裂解体系，结合纯度、收率与成本确定TFA ∶苯甲硫醚 ∶EDT ∶苯甲醚(90 ∶5 ∶3 ∶2)为裂解体系。

许多生物活性肽存在二硫键，二硫键对多肽的构象及生物活性有重要影响，首次环化时本文对空气氧化，铁氰化钾氧化法，DMSO 氧化和H2O2氧化形成二硫键进行了比较，发现H2O2氧化操作简单、用时短，产品纯度较高，并且产生的副产物为水，对多肽的影响较少。第二对二硫键环化时采用的碘氧化法，脱出Cys上的Acm保护基同时进行二硫键的链接。该方法操作简便，纯化时碘易除去。

2.26的抑菌活性

6的MIC实验结果见表1。由表1可以看出，6对金黄色葡萄球菌26001-26，白葡萄球菌26069-5，大肠杆菌临床菌L与Z的MIC均为5.0 μg·mL-1。

6的抑菌圈实验结果见表2。由表2可以看出，6对四种菌均有明星的抑菌活性。本合成方法合成的6具有对抗革兰氏阳性菌和阴性菌的作用，且作用明显。

表1　6对供试菌的MIC

*“-”表示未长菌，“+”表示长菌。

表2　6的抑菌活性

依据IB-367的结构特点，以固相合成法合成IB-367线性肽，并经过两次环化合成了IB-367，收率34.1%，纯度>95.0%。初步抑菌活性测试结果表明：IB-367对所有供试菌均有一定抑菌活性。

该文所采用的合成方法提高了收率，降低了成本，为工业化生产提供一定的科学依据。

参考文献

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[2]南京工业大学,南京英沛生物技术有限公司. 抗菌肽依色格南的固相合成方法：CN 103 012 563A[P].2013.

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[5]Seo M D, Won H S, Kim J H,etal. Antimicrobial peptides for therapeutic applications:A review[J].Molecules,2012,17(10):12276-12286.

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[9]韩月,尹志峰,赵红玲,等. 普兰林肽的固相合成[J].中国新药杂志,2012:21(9):1046-1049.

[10]唐裕芳,张妙玲,陶能国,等. 苍术挥发油的提取及其抑菌活性研究[J].西北植物学报,2008,28(3):0588-0594.

[11]李艳玲,王德才,史仁玖,等. 泰山黄精内生真菌的分离鉴定及抑菌活性研究[J].中草药,2013,44(11):1490-1494.

收稿日期：2016-04-29

基金项目：河北省海外高层次人才“百人计划”资助项目(E201200002)； 河北省高校重点学科建设项目

作者简介：王小青(1984-)，女，汉族，河北承德人，硕士研究生，助理研究员，主要从事生物活性多肽药物的研发。 Tel. 0314-2290474， E-mail: wangxqsmart@163.com 通信联系人： 王良友，副研究员， Tel.0314-2290640， E-mail: liangywang@yahoo.com

中图分类号：R914.5; O629.7

文献标志码：A

DOI：10.15952/j.cnki.cjsc.1005-1511.2016.07.16116

Solid Phase Synthesis and Anti-microbial Activities of the Antibacterial Peptide IB-367

WANG Xiao-qing1,GAO Yang1,YIN Zhi-feng1,GONG Wen-jing2,ZHAO Hong-ling1,WANG Liang-you1*

(1. Hebei Key Laboratory of Research and Development for Traditional Chinese Medicine, Chengde Medical College,Chengde 067000, China; 2 Chengde Tianchuang Biological Products Corporation, Chengde 067000, China)

Abstract：The linear peptides of IB-367(4) was synthesized according to its peptide sequence by condensation with O-(benzotriazol-yl)-N,N,N′,N′-tetramethy-luronium(HBTU)/N-Ethyldiisopropylamine(DIEA) and deprotection with trifluoroacetic acid/thioanisole/1,2-ethanedithiol/anisole, using rink amide resin as the solid supporter, and Fmoc-amino acids as raw materials. The cyclic peptide of IB-367(5) was formed by oxidation of 4 with H2O2. The antibacterial peptide IB-367(6) with yield of 34.1% and purity>95.0% was obtained by oxidation of 5 with I2. The structure was confirmed by MS(ESI) and amino acid composition analysis. MIC of 6 on Escherichia coli and Staphylococcus aureus was 5.0 μg·mL-1.

Keywords：IB-367; solid phase synthesis; disulfide bond; antimicrobial activity