聚唾液酸-透明质酸接枝聚合物的合成及其在药物缓释载体中的应用

付　浩, 冯昌雨, 詹晓北, 朱　莉, 吴剑荣

(江南大学 生物工程学院 糖化学与生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡　214122)



·研究论文·

聚唾液酸-透明质酸接枝聚合物的合成及其在药物缓释载体中的应用

付浩, 冯昌雨, 詹晓北, 朱莉, 吴剑荣*

(江南大学 生物工程学院 糖化学与生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡214122)

摘要：聚唾液酸(PSA)经环氧氯丙烷活化后，与透明质酸(HA)在碱性条件下反应合成了系列PSA-HA接枝聚合物(P1～P5, PSA与HA质量比分别为1 ∶1～5 ∶1)，合成率40%～89%，其结构经FT-IR，元素分析和SEM表征。以胰岛素为模型药物，将P2与胰岛素按2 ∶1(m/m)混合时，包封率和载药率分别为85%和38%，平均粒径为3.2 μm。体外释药试验结果表明: P2对胰岛素有一定的体外缓释能力，在6 h内释药89%；在pH 1.2条件下的释药速度大于pH 7.4条件下的释药速度。

关键词：聚唾液酸; 透明质酸; 接枝聚合物; 合成; 胰岛素; 药物缓释

聚唾液酸(PSA)是由N-乙酰神经氨酸(唾液酸的一种)以α-2,8或α-2,9糖苷键连接的同型聚合物，具有非免疫原性、优良的生物相容性和生物可降解性，是一种优良的生物材料[1-2]。目前，PSA经修饰后广泛应用于蛋白药物的缓释包埋材料和神经修复手术中的支架材料[3-4]。此外，PSA还具有诱导和支持神经原细胞再生的功能，可以加速神经创伤的愈合，也用作神经细胞组织工程材料[5-6]。

透明质酸(HA)是一种存在于高等动物机体内多种组织器官中的天然大分子多聚糖，主要成分是葡糖醛酸和N-乙酰氨基葡糖，具有良好的生物相容性和高粘弹性[7]，以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种重要的生理功能[8]。但HA属于糖胺多糖(GAGs)，在体内易被酶降解，而HA可修饰位点较多，因此通过合成改性后的HA聚合物稳定性将得到提高[9]。目前，与HA接枝合成的聚合物包括羧甲基纤维素钠、葡聚糖、聚乙二醇、海藻酸钠、壳聚糖及明胶等[10-15]。此外，HA还具有与细胞表面特异受体专一性结合的能力，以达到药物增稠、药物缓释、促进药物透皮吸收及靶向性的目的，使得HA及其衍生物常作为药物缓释基材[16]。例如，Jederstrom等[17]利用HA作为多肽类药物胰岛素的载体进行动物实验，研究发现血液中葡萄糖浓度明显降低，证实HA对胰岛素进入机体起到很好的保护作用。

胰岛素是临床上治疗Ι型糖尿病的一线药物[18]，但是胰岛素自身稳定性差，口服易被胃肠道酶水解，且对肠道粘膜通透性低，口服生物利用度一直较低[19]。

鉴于此，本研究结合PSA和HA的优点，以PSA和HA为基质材料，将PSA经环氧氯丙烷活化后，与HA在碱性条件下合成了系列PSA-HA接枝聚合物(P1～P5, PSA与HA质量比分别为1 ∶1～5 ∶1, Scheme 1)，合成率40%～89%，其结构经FT-IR、元素分析和SEM表征。

以胰岛素为酸性多肽模型药物，用接枝聚合物包埋胰岛素，使其兼具PSA的抗免疫识别和HA的与细胞表面特异受体专一性结合的能力，促进药物吸收，提高药物稳定性和半衰期。并通过体外释放试验测定接枝聚合物对胰岛素的体外缓释能力。

Scheme 1

1实验部分

1.1仪器与试剂

Thermo Nicolet NEXUS型红外光谱仪(KBr压片)；Vario EL Ⅲ型元素分析仪；Agilent 1100型高效液相色谱仪[色谱柱：InertSustain C18(4.6 mm×250 mm i.d, 5 μm)，柱温:40 ℃，流动相：0.2 mol·L-1硫酸盐缓冲液，流速：1 mL·min-1，进样体积：20 μL；检测波长：214 nm]； FEI Quanta 200型扫描电镜。

PSA(α-2,8糖苷键连接，相对分子质量为10万Da)，自制；HA，山东福瑞达生物医药有限公司；胰岛素(28.2 U·mg-1)，徐州万邦金桥制药有限公司；其余所用试剂均为分析纯。

1.2P1～P5的制备

将PSA 1.5 g溶于10 mL水中，加入环氧氯丙烷0.4 mL和NaOH 0.05 g，搅拌下于30 ℃反应3 h。旋蒸除去环氧氯丙烷，以水/乙醇(V/V=1/4)为溶剂采用离心-溶剂沉淀法制得活化的PSA(采用硫代硫酸钠滴定法[20]测定PSA的环氧基修饰密度)。

取活化的PSA 1.5 g加至1.5%(w/V)的HA溶液(100 mL)中，搅拌下于30 ℃反应56 h。减压浓缩后用分子截留量为50万Da的透析袋透析，利用间苯二酚法[21]检测透析液中的PSA，直至溶液中未检测出PSA，将透析袋内溶液经冷冻干燥得P1(PSA与HA质量比为1 ∶1)。

改变PSA与HA质量比，用类似方法制得P2, P3, P4和P5(PSA与HA质量比分别为2 ∶1, 3 ∶1, 4 ∶1和5 ∶1)。

1.3药物包埋

将P 0.5 g冻干粉末溶于1 mol·L-1Na2SO4溶液中(P终浓度为8.5 mg·mL-1)，静置过夜，用1 mol·L-1盐酸调至pH 2.0。另取胰岛素60 mg溶于0.01 mol·L-1盐酸(3 mL)中，依据P与胰岛素的质量比分别为6 ∶1, 6 ∶2, 6 ∶3, 6 ∶4, 6 ∶5和6 ∶6，将两溶液混合反应1 h。置于Tris缓冲液(0.5 mmol·L-1， pH 6.5)中透析48 h，其间更换透析液一次，袋内悬浊液于20 000 r·min-1离心30 min，沉淀冷冻干燥后得P/胰岛素粉末。

1.4包封率与载药率测定

采用HPLC检测上述透析液及离心所得上清液中的胰岛素含量。按下式计算胰岛素包封率和载胰岛素率：

1.5P/胰岛素体外释放试验

将P/胰岛素分别置于pH 1.2盐酸溶液10 mL和pH 7.4 PBS缓冲溶液10 mL中，于37 ℃恒温水浴中振荡(100 r·min-1)，每隔30 min移取1 mL释放介质，用HPLC检测样品中胰岛素含量，同时补充同温同体积的释放介质。

2结果与讨论

2.1反应条件优化

(1) PSA的活化

环氧氯丙烷分子中含有高活性易于进行取代反应的氯离子以及易于开环聚合的环氧结构，在聚合物合成、介质交联中具有方便、快速、活化率高、毒性低等特点而得到广泛应用。本研究采用环氧氯丙烷活化PSA，进行单因素试验，分别考察了环氧氯丙烷浓度、氢氧化钠浓度、活化时间和活化温度对PSA上环氧基活化密度的影响，结果见图1。由图1可以看出，基于获得高环氧基活化密度为目标，综合考虑各因素的影响，得出最佳反应条件为：环氧氯丙烷浓度6%(V/V)，氢氧化钠浓度0.7%(w/V)，活化时间4 h，活化温度35 ℃，其环氧基活化密度可以达到1.5 mmol·g-1。

该方法制得的活化PSA没有发现不溶物，但由于PSA是大分子，本身活化过程不易进行，且活化反应的产物因带有环氧基可以继续与PSA上的羟基反应生成交联反应的产物，生成的交联产物又可与活化产物或环氧氯丙烷发生反应生成更进一步的交联产物，因此活化的时间不宜过长，已活化的PSA需尽快进行下一步反应。

(2) P的合成

将已活化PSA与HA反应合成PSA-HA聚合物P， PSA与HA的质量比[x=m(PSA) ∶m(HA)]对透析液中PSA含量和P接枝率的影响见图2。由图2可见，P的接枝率为40%～89%；当x=1 ∶1～2 ∶1时，PSA得到高效利用，接枝率高达87%～89%；而当x>2 ∶1后，PSA的利用率逐渐下降。这是由于HA的量固定，提高PSA的量，并不能增加HA上连接的PSA量。但由于HA分子量较大，在体内降解速率较快，如聚合物中HA所占比例越大，其降解速度越快。因此选择x=2 ∶1制备PSA-HA聚合物(P2)进行下一步反应，以期提高PSA的量，降低聚合物的降解速率和提高药物的附载量。

环氧氯丙烷浓度/(V/V)

NaOH/(w/V)

活化温度/℃

m(PSA) ∶m(HA)

2.2表征

(1) SEM

PSA, HA和P2的扫描电镜分析结果见图3。从图3可以看出，PSA为片状；HA为枝状，形状规则，结构疏松，易和PSA发生接枝合成反应；P2中可以看到交错枝状分子上包裹有片状物质，推测其为PSA，交错枝状分子为HA，可初步判断PSA与HA发生了接枝合成反应。

PSAHA

P2

(2) FT-IR

图4为PSA, HA和P2的IR谱图。由图4可见，HA和PSA在3 450 cm-1处出现O—H与N—H的伸缩振动吸收峰重叠而成的宽峰，说明羟基和氨基之间存在着强弱不同的分子内或分子间氢键，峰宽的差异反映了氢键的强弱。P2在3 385 cm-1处强而宽的吸收峰，可能是由于PSA与HA结合后增强了羟基和氨基之间的氢键，使吸收加强；2 892 cm-1处吸收峰为HA和PSA上的甲基和次甲基的C—H伸缩振动吸收峰；1 738 cm-1和1 616处的吸收峰分别为HA上的(COO-)和酰胺带Ⅲ的特征吸收峰，表明P2上有HA的特征吸收峰；PSA上的1 433 cm-1处吸收峰消失，1 102 cm-1处吸收峰发生迁移，HA上1 151 cm-1处吸收峰发生迁移。上述分析表明PSA和HA发生了有效的接枝合成反应。

ν/cm-1

(3) 元素分析

PSA, HA和P2的元素分析结果见表1。由表1可以看出，PSA的N和C含量相对较少，而纯HA的N和C含量分别为3.87%与39.79%， P2的N和C含量介于两者之间，进一步证明PSA与HA接枝合成成功。通过C和N含量利用元素分析法[22]计算得P2的接枝率为88%。

表1　PSA, HA和P2的CHN元素分析结果

(4) Zeta电位

PSA, HA和P2的电位分布测试结果见图5。由图5可以看出，当pH<3时，P2带正电荷；当pH>3时，P2带负电，随着pH增大，出现了电荷由正到负的转变。对比HA和PSA发现，P2的电荷介于两者之间，这是由于在低pH环境下，HA上的基团质子化程度较大，使得P2的净电荷为正，Zeta电位值为正。随着pH值升高，HA上的羧酸根电离程度增大，使得Zeta电位值递减较PSA的快，进而P2的Zeta电位值也逐渐递减，从带正电荷转变为带负电荷，而由于HA与PSA存在相互作用，受PSA的影响，P2的电位值小于HA的电位。因而，当pH>3时，P2由于所带负电荷逐渐增加，利用静电作用，P2可作为带相反电荷多肽类药物的载体。

pH

2.3P2包埋胰岛素及表征

为了考察P2对多肽类药物的缓释能力，以胰岛素为模型蛋白进行包埋实验。胰岛素的羧基随pH升高而逐渐电离，只要pH低于其等电点(等电点为5.4)，胰岛素分子始终带正电。因此，选择pH在3.0～5.4之间，通过改变P2与胰岛素的质量比，考察P2的包封率和载药率的变化，结果见图6。由图6可以看出，P2的包封率和载药率与胰岛素的添加量有关，当二者质量比小于6 ∶3时，包封率增加，载药率上升，说明P2与胰岛素具有良好的亲和力；随着胰岛素添加量的增加，质量比高于6 ∶3时，载药率上升缓慢，包封率下降。这是因为聚合物对于胰岛素的负载能力是有一定限度的，即呈现饱和性。综合考虑包封率与载药率，当P2与胰岛素质量比为6 ∶3时，包封率较高(≥85%)，同时载药率也较高(≥38%)，效果最佳。因此，选择P2与胰岛素质量比为6 ∶3进行后续试验。

m(P2) ∶m(胰岛素)

对P2载胰岛素进行电镜扫描，结果见图7。由图7可以看出，P2粒子大小为1～10 μm。通过Zeta电位仪检测粒度平均大小为3.2 μm，属于小肠有效吸收的范围。2004年，Jederstrom等[16]曾用HA和重组生长激素(rhGH)在低pH(<3)下混合制备成了小于1 nm的粒子；用HA复合胰岛素后得到了2～10 nm大小的复合物，溶液澄清透明。而本实验中P2/胰岛素复合物簇拥成团，这可能是在透析过程中，由于透析袋内溶液(初始pH为2.0)与Tris缓冲液(初始pH为6.5)中和，使得透析袋内溶液pH值不断升高，胰岛素的羧基逐渐电离，只要pH值低于其等电点5.4，胰岛素分子始终带正电；P2在pH 3.0以上时，带负电。从而在pH 3.0～5.4间，P2与胰岛素之间的电荷吸引力成为主导，而HA分子量大导致形成了聚离子复合物。

图7 P2载胰岛素扫描电镜图

2.4P2包埋胰岛素体外释放试验

以pH 1.2盐酸溶液、pH 7.4 PBS缓冲液分别模拟胃液和肠液pH环境，考察P2载胰岛素在不同pH介质中释放胰岛素的情况，结果见图8。由图8可以看出，在pH 1.2盐酸溶液中，胰岛素的释药速度大于在pH 7.4的PBS缓冲液中的释药速度，在6 h内逐渐释放率为89%。聚离子复合物主要靠聚离子与两性大分子上电荷基团相互静电引力形成，当外界环境pH偏离等电点时，电荷性质发生变化，导致复合物解离，胰岛素释放出来。在pH 1.2条件下的释药速度较快，一方面可能是由于PSA在酸性条件下较活泼，容易从聚合物上解离下来，导致聚合物的性质发生变化，另一方面与介质的pH值远远偏离等电点有关，当介质在pH 2.0以下时，P2带正电荷(如图5所示)，而胰岛素在介质pH低于5.4时也带正电荷。所以在pH 1.2 的介质中，P2很快解离，胰岛素释放较快。

时间/h

利用聚唾液酸(PSA)和透明质酸(HA)为基质材料，通过环氧氯丙烷合成了系列PSA-HA聚合物(P1～P5, PSA与HA质量比分别为1 ∶1～5 ∶1)，合成率40%～89%。最佳合成条件为：环氧氯丙烷浓度6%(V/V)，氢氧化钠浓度0.7%(w/V)，活化时间4 h，活化温度35 ℃， PSA与HA质量比为2 ∶1时合成达到饱和。

以胰岛素为模型药物，将PSA-HA聚合物与胰岛素混合，当PSA-HA ∶胰岛素质量比为2 ∶1时，既能达到较高的包封率(≥85%)又可达到较高的载药率(≥38%)，平均粒径为3.2 μm。体外释放试验表明：包封胰岛素在6 h内释药89%；由于在pH 1.2的介质中，复合物很快解离，胰岛素释放较快，使得在pH 1.2条件下的释药速度大于pH 7.4条件下的释药速度。因此，PSA-HA作为新的聚合物有望成为多肽类药物的缓释载体。

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收稿日期：2015-08-25;

修订日期:2016-02-25

基金项目：江苏省自然科学基金资助项目(BK2011158)

作者简介：付浩(1990-),男,汉族,贵州遵义人,硕士研究生,主要从事糖生物工程的研究。 E-mail: fhao005@163.com 通信联系人： 吴剑荣，硕士生导师， E-mail: kinowu@jiangnan.edu.cn

中图分类号：O63; R318.08

文献标志码：A

DOI：10.15952/j.cnki.cjsc.1005-1511.2016.07.15299

Preparation and Application of Polysialic Acid-Hyaluronan Grafted Polymer as Drug Delivery Carrier

FU Hao,FENG Chang-yu,ZHAN Xiao-bei,ZHU Li,WU Jian-rong*

(The Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Biotechnology,Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

Abstract：The grafted polymers(P1～P5) with different mass ratio(1 ∶1～1 ∶5) of hyaluronic acid with polysialic acid were prepared by reaction of hyaluronic acid(HA) with activated polysialic acid(PSA) by epichlorohydrin under alkaline conditions. The synthetic ratio was about 40%～89%. The structures were characterized by FT-IR, elemental analysis and SEM. Taking insulin as a model drug, when the P2and insulin were mixed by the ratio of 2 ∶1(m/m), the encapsulation efficiency and drug loading was 85% and 38%, respectively. The average particle size was 3.2 μm. In vitro release test showed a slow-release capability of the embedding insulin by P2. The drug release rate reached 89% within 6 h. The drug release rate was faster in pH 1.2 than that in pH 7.4.

Keywords：polysialic acid; hyaluronan; grafted polymer; preparation; insulin; drug delivery