深绿木霉1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶基因的克隆及表达1)

刁桂萍　李松阳　王志英

(东北林业大学，哈尔滨，150040)



深绿木霉1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶基因的克隆及表达1)

刁桂萍李松阳王志英

(东北林业大学，哈尔滨，150040)

摘要以深绿木霉(Trichoderma atroviride)ACCC30153为试材，应用聚合酶链式反应(PCR)技术克隆获得1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶ACCD基因的cDNA全长。结果表明：此基因的cDNA编码区序列全长1 083 bp，编码区可编码360个氨基酸。经BlastP相似性分析，其属于Try-synth-beta-Ⅱ家族，与里氏木霉(T. reesei)氨基酸序列XP-006967764的同源性最高，达到91%。在5种不同诱导条件下，ACCD基因的表达量均有明显变化。在C、N饥饿培养基中分别培养8 h与16 h时，ACCD基因表达量达到最大值，为未诱导时的22.7倍与22.4倍；在山新杨叶粉与茎粉的诱导下，ACCD的表达量分别在培养的24 h与2 h达到最大，为未诱导的22.6倍与27.3倍。

关键词深绿木霉；脱氨酶；诱导表达

1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶(ACC脱氨酶)广泛存在于多种微生物中，它能催化乙烯前体分解来降低植物体内乙烯的合成，从而减少过量乙烯对植物自身生长造成的不良影响[1]。大量研究发现，土壤中微生物产生的ACC脱氨酶能促进植物根部的生长发育[2-4]；而近年来研究也发现，ACC脱氨酶能减轻非生物因素(如干旱、重金属、盐碱等)对植物的危害[5-7]。此外，部分研究证明，含有ACC脱氨酶的细菌能减轻植物病害[8-9]，但ACC脱氨酶与病原菌的作用机制还不清楚。

木霉菌(Trichodermaspp.)是一种极具应用价值的生防菌，不仅能抑制多种病原真菌，还能促进植物生长、诱导其免疫能力，更是具有降解土壤中盐类化合物、农药残留物及重金属离子等的功能[10]。然而，对于木霉菌中ACC脱氨酶生防功能的研究尚不多见。仅有的研究表明，深绿木霉(T. atroviride)通过产生ACC脱氨酶降解植物根部的乙烯前体，减少植物根部乙烯的合成来促进番茄幼苗的生长[11]；棘孢木霉(T. asperellum)T203中的ACC脱氨酶也被证明在促进植物根部生长中起重要作用[12]。本研究通过聚合酶链式反应(PCR)技术获得了深绿木霉ACCC30153中ACC脱氨酶基因的cDNA全长，并研究了不同诱导条件下ACC脱氨酶的表达，为今后进一步研究深绿木霉ACC脱氨酶的生防功能提供参考。

1材料与方法

深绿木霉ACCC30153菌株，购于中国农业微生物菌种保藏管理中心。

根据转录组测序得到的ACCD基因部分cDNA序列设计引物，以深绿木霉ACCC30153菌株菌丝体总mRNA和基因组DNA为模板进行PCR扩增，克隆获得ACCD基因的全长cDNA和DNA序列。

使用ORF查找器寻找ACCD基因的开放读码框；用ExPASy-ProtParam软件分析蛋白质的等电点和相对分子质量等信息；通过BlastP预测蛋白保守区，寻找相似性序列；依据ClustalW软件进行多序列比对。

诱导培养基：MM基础培养基为15g/LNaH2PO4、453mg/LCaCl2、600mg/LMgSO4·7H2O、9.0mg/LFeSO4·7H2O、3.7mg/LCoCl2·7H2O、1.8mg/LMnSO4·H2O、2.5mg/LZnSO4·7H2O，并且含有5g/L(NH4)2SO4和质量分数为0.5%的葡萄糖；C饥饿诱导培养基为MM基础培养基(不含葡萄糖)；N饥饿诱导培养基为MM基础培养基(不含硫酸铵)；山新杨叶粉培养基为MM基础培养基(不含葡萄糖)+1%山新杨叶粉；山新杨茎粉培养基为MM基础培养基(不含葡萄糖)+1%山新杨茎粉。

菌丝体的培养与收集：将106个/mL木霉孢子接种于180mL1/4PD培养基中，于28 ℃、200r/min培养36h。然后，将菌丝体收集转接到上述5种诱导培养基中，分别于0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、24.0h收集菌丝体，保存到冰箱中(-80 ℃)备用(重复3次)。

采用Trizol方法提取木霉菌丝体RNA，用DNA酶消化RNA中的DNA。参照TaKaRaPrimeScriptTMRT试剂盒(大连宝生物公司Code：DRR037S)，以消化后的RNA为模板，反转录合成cDNA。将稀释10倍后的cDNA用作RT-qPCR模板。

RT-qPCR反应试剂盒为SYBRGreenRealtimePCRMastermix(ToyoboCo.,Ltd,Osaka,Japan)。反应体系为2×SYBRGreenRealtimePCRMastermix10μL、引物(10μmol/L)各0.5μL、去离子水6μL、cDNA模板3μL。RT-qPCR反应条件：95 ℃预变性30s；95 ℃ 5s、59 ℃ 15s、72 ℃ 10s；81 ℃读板1s，45个循环(引物序列见表1)。

表1　RT-qPCR引物

2结果与分析

2.1深绿木霉ACCD基因的克隆与生物信息学分析

深绿木霉ACCD基因的cDNA全长为1 083bp，共编码360个氨基酸。ProtParam预测表明，该蛋白的相对分子质量为38140，理论等电点为6.13。通过BlastP进行保守区预测(见图1)，该蛋白基因属于Try-synth-beta-Ⅱ家族，具有Try-synth-beta-Ⅱ家族的保守区结构域。

图1　ACCD保守区预测

通过NCBI的BlastP对ACCD基因进行同源性搜索，在GenBank的数据库中与深绿木霉ACCD基因氨基酸序列匹配的序列共有100个，相似性为65%～91%。随机选取14个ACCD基因进行多序列比对，结果表明：深绿木霉ACCD基因氨基酸序列与里氏木霉(XP-006967764)氨基酸序列的同源性最高为91%。含有2个高度保守的结构域，其中氨基酸序列的第295位和322位分别为Glu(E)和Leu(L)，证明该蛋白质具ACC脱氨酶活性(见图2)。

2.2深绿木霉ACCD基因在不同诱导条件下的表达

采用实时荧光定量PCR方法检测了5种不同培养基诱导的深绿木霉ACCD基因在转录水平上的变化。RT-qPCR分析结果显示(见表2)：在MM培养基培养条件下，深绿木霉ACCD基因在24h内呈连续上调表达，在16h时达到最大值，为未诱导时的23.5倍。在C、N饥饿培养条件下，该基因在培养的24h内均呈先上调后下降又大幅上调的表达趋势。在C饥饿培养中培养8h时，ACCD基因表达量达到最大值，为未诱导时的22.7倍；在N饥饿培养条件下，ACCD基因表达量在培养16h时达到最大值，为未诱导时的22.4倍。在山新杨叶粉培养基培养条件下，ACCD基因在24h内呈上调表达趋势，诱导仅1h表达量开始急剧上升，在24h时达到最大值，为未诱导时的22.8倍。经山新杨茎粉诱导后的ACCD基因表达量急剧上升，在第2h达到最大值，为未诱导时的27.3倍；此后，随培养时间延长，该基因表达量急剧下降。

XP_006967764为里氏木霉(Trichoderma reesei)；XP_013951488为绿色木霉(Trichoderma virens)；KKO97124为哈茨木霉(Trichoderma harzianum)；ACX94231为棘孢木霉(Trichoderma asperellum)；XP_013945914为深绿木霉(Trichoderma atroviride)；KUE98859为盖姆斯木霉(Trichoderma gamsii)；XP_007816500为绿疆菌(Metarhizium robertsii)；KID86421为绿疆菌(Metarhizium guizhouense)；XP_008597946为白僵菌(Beauveria bassiana)；KPM40848为杓兰菌根菌(Neonectria ditissima)；CCT63766为镰刀菌(Fusarium fujikuroi)；KPA39012为镰刀菌(Fusarium langsethiae)；KLP01246为镰刀菌(Fusarium fujikuroi)；KIL92883为镰刀菌(Fusarium avenaceum)。

图2　ACCD氨基酸序列多序列比对

注：表中数据为“平均值±标准差”。

3结论与讨论

1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶(ACCD)是一种能抑制植物体内乙烯合成的胞内聚合酶，能切断植物激素乙烯合成前体，从而降低了环境与病原菌诱导对植物生长的抑制[3]。本研究克隆了深绿木霉ACCC30153中ACCD基因的全长cDNA序列，该基因的cDNA全长为1083bp，编码区可编码360个氨基酸。通过预测得知该蛋白属于Try-synth-beta-Ⅱ家族，且蛋白不含信号肽，是一种胞内酶。有研究表明，土壤中的天然细菌产生的ACC脱氨酶可将植物细胞中的乙烯前体分解，并利用其分解物做C源和N源，供自身利用[13]。本研究发现，在C、N饥饿条件下，深绿木霉中的ACCD基因表达呈上调趋势，说明该基因在木霉应对缺乏营养的条件过程中起到一定作用。而通过模拟深绿木霉与植物互作的研究发现，在与植物茎的互作过程中，ACCD基因会在互作的前期上调表达，表明当木霉受到山新杨茎中的ACC诱导后，导致其ACC脱氨酶转录水平提高，而随着培养时间的增强，植物茎所含ACC被分解，ACCD基因的表达也会随之下降[14]。ACCD最早是从土壤细菌中分离出来的。近年来发现，ACCD不仅存在于细菌中，在真菌中也检测到了它的活性。但是，具体作用还没有进行深入研究，本研究结果可为今后进一步研究深绿木霉ACCD基因的功能提供参考。

参考文献

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第一作者简介：刁桂萍，女，1981年11月生，东北林业大学林学院，副教授。E-mail：dgp2003@126.com。 通信作者：王志英，东北林业大学林学院，教授。E-mail：zyw0451@sohu.com。

收稿日期：2016年4月13日。

分类号Q933

CloningandDifferentialExpressionofAnACCDeaminaseGenefromTrichoderma atrovirideACCC30153//

DiaoGuiping,LiSongyang,WangZhiying

(NortheastForestryUniversity,Harbin150040,P.R.China)//JournalofNortheastForestryUniversity，2016,44(8)：104-107.

ThecDNAofACCdeaminase(ACCD)genewasisolatedfromTrichoderma atrovirideACCC30153byusingPCR.ThecDNAsequenceofACCDwas1 083bpinlength,encoding360aminoacids.BlastPsearchindicatedthatACCDbelongedtoTry-synth-beta-Ⅱfamilyanditshownthehighestsimilarity91%withaproteinofT. reesei (XP-006967764). ACCDwasproventobedifferentiallytranscribedunderfivedifferenttreatments. ACCDtranscriptswereup-regulatedundernutritionalstressconditionswithpeaktranscriptionlevelsof22.7and22.4times,at8hand16h,respectively. ACCDtranscriptionwasalsoup-regulatedby1%leafandstempowderofPopulus davidiana×P. albavar. pyramidalis,withpeaktranscriptionlevelsof22.6and27.3times,at24hand2h,respectively.

KeywordsTrichoderma atroviride； ACC deaminase； Differential expression

1)中央高校基础科研业务费专项资金项目(2572014BA08)；中国博士后科学基金面上项目(20110491014)；黑龙江省博士后资助经费。

责任编辑：张玉。