HIF-1α对病理性瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖活力的影响及机制

胡强，隋爽，王国栋，姚利民

(解放军第107医院 烧伤整形科，山东 烟台 264000)

HIF-1α对病理性瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖活力的影响及机制

胡强Δ，隋爽，王国栋，姚利民

(解放军第107医院 烧伤整形科，山东 烟台 264000)

目的 探究低氧诱导因子(hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α)在病理性瘢痕疙瘩发生中的具体作用机制，寻找瘢痕疙瘩治疗的重要靶位点。方法 Real time PCR和Western blot检测正常组织和瘢痕疙瘩中HIF-1α的mRNA及蛋白表达。MTT法检测不同氧浓度环境下(20%、10%、5%、2%和1%)正常组织和瘢痕疙瘩中成纤维细胞的活性，检测瘢痕疙瘩在5%低氧环境与20%正常氧环境下HIF-1α的mRNA及蛋白表达。HIF-1α shRNA病毒沉默HIF-1α后采用流式细胞仪检测5%低氧环境下瘢痕疙瘩中成纤维细胞的数量变化。结果 Real time PCR和Western blot检测结果显示瘢痕疙瘩成纤维细胞中HIF-1α的表达较正常组织明显升高(P<0.05)，且在低氧环境中(氧浓度5%、2%和1%)的成纤维细胞活性较正常组织显著升高(P<0.05)。瘢痕疙瘩中成纤维细胞中HIF-1α的mRNA及蛋白表达在5%低氧环境显著高于20%正常氧环境(P<0.05)。当沉默瘢痕疙瘩中HIF-1α的表达后，5%低氧环境中的成纤维细胞凋亡数量显著高于对照组[(0.021±0.001)% vs.(3.739±0.039)%,P<0.05]。结论 HIF-1α在病理性瘢痕疙瘩成纤维细胞中显著升高且促进成纤维细胞的增殖及活力，对瘢痕疙瘩的形成具有一定的促进作用。

HIF-1α；瘢痕疙瘩；成纤维细胞；增殖

病理性瘢痕疙瘩是整形外科学常见的临床并发症，且由于病理性瘢痕疙瘩成纤维细胞具有过度增殖能力导致术后瘢痕的不可控性[1]，同时成纤维细胞分泌大量胶原，导致瘢痕疙瘩对周边压迫以及瘢痕挛缩可导致不同程度的功能障碍，造成患者术后的诸多不适[1-2]。尽管目前国内外众多学者开始对瘢痕进行更为细致深入的研究[3]，如二甲双胍可能对瘢痕疙瘩的形成有抑制作用[4]，但是由于病理性瘢痕疙瘩是一个逐渐进展的受众多基因调控的病理过程[5]，目前对于病理性瘢痕疙瘩的形成机制尚不明确，同时对于瘢痕疙瘩的治疗亦是一个科学难题。

对于病理性瘢痕疙瘩的形成，可以归结为3个方面：瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖及活性较高，胶原合成功能旺盛以及具有一定的内分泌功能。瘢痕愈合过程中主要的效应细胞为成纤维细胞，且瘢痕组织中该细胞的增殖和合成分泌功能多较为活跃，细胞的过度增殖和胶原的过度堆积最终导致创面修复过度，形成病理性瘢痕。对于这一个病理过程最重要的调控因素即低氧，而低氧诱导因子(hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α)作为一个重要的低氧条件下的响应因子，可以调节不同的转录组基因，包括血管生成因子、代谢酶等基因[6]，介导缺氧条件下细胞周期进程和信号转导的调控[7-8]。本研究旨在探究HIF-1α在病理性瘢痕疙瘩发生中的具体作用机制，寻找瘢痕疙瘩治疗的重要靶位点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1标本的收集：所有标本均来自本院2013年10月～2014年6月期间在整形外科烧伤瘢痕疙瘩修复手术的患者标本，共10例，年龄25～63岁，作为病例组；同时选择同期因其他疾病进行手术切除的手术标本周边的正常皮肤组织8例，年龄19～65岁，作为正常对照组进行研究，取材部位均为耳后部皮肤，皮肤大小长约0.5 cm，宽约0.5 cm。所有病例组入组者术前均未进行任何的瘢痕疙瘩的手术以及药物治疗，且标本经病理科医生切片观察，鉴定为瘢痕疙瘩。所有入组者均无局部皮肤的感染以及溃疡，无皮肤病、免疫性疾病、甲状腺疾病以及垂体和肾上腺疾病；所有入组者近期均未服用相应的激素、抗生素以及免疫抑制相关药物。与所有入组者说明取标本的目的以及研究的性质，征得患者的同意并签署患者知情同意书，并通过了医院伦理委员会的批准。

1.1.2 试剂：M199培养基、胰酶购自Thermo公司，胎牛血清购自Ausgenex公司，MTT试剂盒购自上海煊翎有限公司，HIF-1α抗体以及tubulin抗体购自上海银海圣生物科技有限公司。HIF-1αsiRNA病毒购买于上海吉玛有限公司。Trizol试剂、反转录试剂盒、SYBR Green和DEPC水购自Invitrogen公司，氯仿、异丙醇和乙醇购自上海润捷化学试剂有限公司。

HIF-1α引物以及actin引物使用Primer 5.2设计并合成于上海吉玛有限公司，引物序列如下:

HIF-1α forward:ACTTCTTAGCCCGATCGATGCA;

HIF-1α reverse:ACTTGCATCGATCGATCAATCG;

actin forward:ACCGTCCCGTTGTGGAACTGCTG;

actin reverse:CTGATCGTCGCACCCTGCATGTGT。

1.2 方法

1.2.1 原代成纤维细胞的提取：所有手术标本在无菌条件下取材后立即剪成小块(体积约1 mm3)，用培养液冲洗后接种于M199培养液中，加入20%的胎牛血清，置于37 ℃培养箱中培养，在接种的5～7 d后在小块周围长出的生长晕即为成纤维细胞(成纤维细胞为细长状，用Real time PCR检测波形蛋白vimentin作为成纤维细胞标志物[9])，将铺满培养皿的成纤维细胞用胰酶消化后进行传代。

1.2.2 检测正常组织和瘢痕疙瘩中HIF-1α的表达：分别将正常组织和瘢痕疙瘩中提取的成纤维细胞传代，铺板，待细胞汇聚度约80%时提取细胞RNA和蛋白，Real time PCR和Western blot分别检测HIF-1α在mRNA和蛋白水平的含量，实验重复进行3次。

1.2.3 检测不同氧浓度下正常组织和瘢痕疙瘩中成纤维细胞的活性：分别将正常组织和瘢痕疙瘩中提取的成纤维细胞传代，铺板，待细胞汇聚度约60%时，将细胞培养皿(10%FBS的DMEM)放入低氧装置中，使用缺氧/低氧培养装置(Billups-rothenberg公司，MIC-01)设置不同氧浓度20%、10%、5%、2%、1%，其中20%作为正常氧浓度，其他为低氧浓度，37 ℃低氧培养4h后利用MTT实验检测不同氧浓度下细胞的活性。实验重复进行3次，MTT实验步骤参照试剂盒说明。

1.2.4 检测低氧环境下瘢痕疙瘩中HIF-1α的表达：分别将正常组织和瘢痕疙瘩中提取的成纤维细胞传代，铺板，待细胞汇聚度约60%时，将细胞培养皿放入低氧装置中，设置低氧浓度为5%，同时将20%作为正常氧浓度，培养4 h后提取细胞RNA和蛋白，检测低氧浓度下HIF-1α mRNA和蛋白水平的表达，实验重复进行3次。

1.2.5 病毒转染：在目的细胞中(细胞浓度为1.87×106/mL)加入6×107pu的HIF-1α shRNA病毒液10 μL，在对照细胞中(细胞浓度为1.59×106/mL)加入5×107pu shRNA载体病毒10 μL，混匀后放于培养箱(37 ℃、5%CO2)孵育48 h。

1.2.6 MTT法检测细胞存活率：收集对数期细胞，铺板(48孔板)，低氧处理后每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL，即0.5%MTT)培养5 h后再每孔加入200 μL二甲基亚砜，为了使结晶物充分溶解，将细胞培养板置摇床上低速振荡10 min。在酶联免疫检测仪(深圳雷杜，Rayto RT-6000)570 nm处测量各孔的吸光度值。

1.2.7 流式细胞计数法计算细胞数量：为了检测HIF-1α对成纤维细胞增殖的影响，利用流式细胞计数仪检测5%低氧环境下HIF-1α siRNA沉默后的瘢痕疙瘩中成纤维细胞数量，首先将病毒感染后48 h的细胞制备细胞悬液，分别在细胞悬液中加入2 μL PI,分装于专用的流式管中进行检测，每一进样重复3次，以未染PI的细胞为阴性对照，检测细胞染PI的阳性率。

1.2.8 Real time PCR检测HIF-1α mRNA表达：TRIzol法抽提总RNA。经过TRIzol裂解，氯仿去除蛋白，异丙醇沉淀RNA，75%乙醇(用DEPC水配)洗涤沉淀，最后用DEPC水溶解RNA。然后两步法反转RNA，首先RNA和random primer以及dNTP 65 ℃ 5 min,冰浴4 min后，加入M-MLV Buffer、DTT、Rnase out、M-MLV总体积20 μL进行反转录。最后应用荧光实时定量PCR仪(Thermo Ficher,9600型)检测HIF-1α mRNA的表达。

1.2.9 Western blot检测HIF-1α蛋白表达：按照实验操作步骤，进行细胞蛋白抽提，蛋白样品处理，蛋白样品电泳、转膜、封闭、HIF一抗孵育(1:1 000)、山羊抗小鼠IgG二抗孵育(1:5 000)、 胶片的压片检测、凝胶图象扫描(爱普生，V550)分析。

2 结果

2.1 正常组织和瘢痕疙瘩中HIF-1α的表达 正常组织和瘢痕疙瘩中成纤维细胞Real time-PCR(图1A)和Western blot(图1B)结果显示：在瘢痕疙瘩成纤维细胞中HIF-1α在mRNA水平的表达含量较对照组(2.48±0.54 vs.1.00±0.12)及蛋白质水平的表达含量(2.33±0.31 vs.1.00±0.23)均显著升高(P<0.05)，这表明HIF-1α在瘢痕疙瘩中的发生和发展中具有一定的作用。

图1 正常组织和瘢痕疙瘩中HIF-1α的表达(n=3)*P<0.05，**P<0.01，与正常组织比较Fig.1 The expression of HIF-1α in normal tissue and pathological scar(n=3)*P<0.05，**P<0.01，compared with normal tissue

2.2 不同氧浓度下正常组织和瘢痕疙瘩中成纤维细胞的活性 MTT结果显示，在低氧培养条件下，随着氧浓度的降低，病理性瘢痕成纤维细胞细胞仍保持较高活性，而正常组织的成纤维细胞随着氧浓度的升高，细胞活性明显降低，2组之间有明显的差异[5%(0.21±0.03 vs.0.11±0.02)，2%(0.18±0.02 vs.0.07±0.01)，1%(0.15±0.01 vs.0.04±0.01),均P<0.05]。见图2。

图2 不同氧浓度下正常组织和瘢痕疙瘩中成纤维细胞的活性(n=3)*P<0.05，与正常组织比较Fig.2 The activity of fiber cell in pathological scar and normal tissue under different oxygen concentration(n=3)*P<0.05，compared with normal tissue

2.3 低氧环境下瘢痕疙瘩中HIF-1α的表达 由2.2中结果可看出，在5%低氧浓度时，正常对照组成纤维细胞活性明显降低，因此将低氧环境设为5%氧浓度，将正常氧浓度定为20%作为对照，检测低氧环境下瘢痕疙瘩中HIF-1α的表达。由HIF-1α基因的Realtime-PCR和Western blot结果可知，在低氧浓度培养的病理性瘢痕疙瘩成纤维细胞中HIF-1α，无论是在mRNA水平(见图3A)还是在蛋白质表达水平(见图3B)，其表达均明显高于正常氧浓度环境，差异有显著的统计学意义(P<0.05)。见图3。

图3 低氧环境下瘢痕疙瘩中HIF-1α的表达(n=3)*P<0.05，与正常氧环境比较Fig.3 The expression of HIF-1α in pathological scar in hypoxic environment(n=3)*P<0.05，compared with normal oxygen concentration

2.4 检测HIF-1α shRNA病毒沉默效果 利用HIF-1α shRNA病毒转染瘢痕疙瘩中成纤维细胞，48 h后检测HIF-1α shRNA病毒沉默效果，发现较对照组，HIF-1α shRNA病毒在mRNA水平(1.00±0.21vs.0.48±0.43)和蛋白质水平(1.00±0.43vs.0.38±0.37)均显著抑制HIF-1α的表达(P<0.05)，表明HIF-1α shRNA病毒有效沉默HIF-1α基因表达。见图4。

图4 HIF-1α shRNA病毒沉默效果(n=3)*P<0.05，与对照组比较Fig.4 The silence effect of HIF-1α shRNA virus(n=3)*P<0.05，compared with control group

2.5 HIF-1αshRNA沉默后的瘢痕疙瘩中成纤维细胞的数量变化 流式结果显示，与对照组(0.021±0.001)%比较，HIF-1αshRNA沉默组瘢痕疙瘩中成纤维细胞的凋亡数量明显增加(3.739±0.039)%，差异有显著的统计学意义(P<0.01)。见图5。

图5 HIF-1αshRNA沉默后的瘢痕疙瘩中成纤维细胞的凋亡变化Fig.5 The changes of the number of fibroblasts after the silence of HIF-1α

3 讨论

病理性瘢痕疙瘩是由于细胞增殖、细胞分泌、细胞分化与细胞凋亡等过程紊乱所致的组织细胞的异常生长所致。当机体受到创伤，机体会调动一切因素，促进自愈。因此瘢痕组织中细胞的代谢速率较高，同时由于瘢痕组织中血管新生是一个血管内皮细胞的激活、增殖、迁移、重建形成新血管和血管网的复杂过程，其进程较慢，且瘢痕疙瘩中的血管较正常组织中明显较少，最终导致高代谢的瘢痕组织呈现低氧状态，因此低氧是病理性瘢痕疙瘩形成的关键病理因素之一。

细胞对缺氧的基本的适应性改变是改变一系列基因的表达，改变细胞的代谢水平，这是哺乳动物正常生理机能所必需的[10]。在阻止正常细胞分裂的同时，低氧耐受细胞的增殖以及活性增加对于自身生存能力的维护也是必要的。许多的研究报道指出，缺氧条件下细胞阻滞或增殖是由特定的细胞系、低氧张力决定的[11]，而HIF-1α是调控这一复杂过程的重要介导因子，不仅参与调控低氧条件下众多基因的改变，而且在肿瘤血管形成、肿瘤组织的低氧代谢以及侵袭转移中均具有极其关键的作用[12]。HIF-1是一种异源二聚体，能持续性表达芳香烃受体核转位蛋白(aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator，ARNT )和低氧诱导因子(HIF-1α)。HIF-1α受细胞O2浓度的影响改变其转录活性。在常氧条件下，HIF-1α半衰期不到5min。蛋白质稳定性是通过两个脯氨酸残基羟基化进行调节的，并受脯氨酰羟化酶家族的控制。HIF-1α的脯氨酰羟化酶在常氧条件下可以导致VHL蛋白的粘合和蛋白体的退化[13]。

本研究发现在瘢痕疙瘩成纤维细胞中HIF-1α在mRNA及蛋白质水平的表达含量均显著高于正常皮肤组织(P<0.05)，且低氧浓度培养的病理性瘢痕疙瘩成纤维细胞中HIF-1α表达水平明显高于正常皮肤成纤维细胞(P<0.05)。随着氧浓度的降低，病理性瘢痕成纤维细胞细胞仍保持较高活性，而正常组织的成纤维细胞随着氧浓度的降低，细胞活性明显降低，然而当瘢痕疙瘩成纤维细胞中HIF-1α基因沉默后，其凋亡数量明显增加(P<0.05)，表明HIF-1α在病理性瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖以及活力中具有一定的促进作用。

尽管HIF-1α对于瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖和细胞活力具有一定的影响[14]，然而HIF-1α在调控基因参与细胞周期阻滞的作用一直不明。有研究发现缺氧环境下的细胞，其细胞周期被阻碍在G0/G1期，HIF-1α可以诱发G0/G1期的细胞积累[15]，同时BrdU试验也发现缺氧细胞很快增殖下降[16]，那么HIF-1α是如何调控细胞周期的进程将是本课题组下一步研究的重点。Gardner等的研究表明：p27和p21是低氧诱导细胞阻滞的主要决定因素[17]，在缺氧条件下，CKIs(如p27、p21，p57)上调，Rb去磷酸化，p27是第一个被指出与细胞周期调节蛋白-CDK复合物结合，并参与促进RB的去磷酸化的物质[18]。在缺氧条件下HIF-1α调控下的成纤维细胞的细胞周期阻滞是否和p21及p27有关，也将是本课题组下一步研究的重点。同时肝脏、心脏以及肾脏的纤维化也可看做是一种病理性的修复过程[6,19-20]，那么HIF-1α在这些纤维化疾病中是否也具有一定的作用呢？这些问题同样值得探究。

综上所述，本研究发现在瘢痕疙瘩成纤维细胞中，HIF-1α是缺氧诱导成纤维细胞增殖的促进因素，在缺氧条件下HIF-1α促进成纤维细胞增殖及生长活性，抑制其凋亡，在瘢痕疙瘩的形成中具有重要作用，是瘢痕疙瘩药物研发的重要靶点。

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(编校：王俨俨)

Effect of HIF-1α on proliferation of pathological scar fibroblasts and its mechanism

HU QiangΔ, SUI Shuang, WANG Guo-dong, YAO Li-min

(Department of Burn & Plastic surgery, No.7 Hospital of PLA, Yantai 264000, China)

ObjectiveTo explore the effect of hypoxia-inducible factor 1α(HIF-1α)in pathological scar and its specific mechanism,and the therapy target of pathological scar.MethodsReal time PCR and Western blot was used to test the expression of HIF-1α in normal tissue and pathological scar,meanwhile to detect the effect of hypoxic environment on the expression of HIF-1α.Fibroblasts activity in pathological scar and normal tissue under different oxygen concentration(20%,10%,5%,2% and 1%)was determined by MTT method.Determine the different expression of HIF-1α mRNA and protein in normal environment(20% oxygen)and hypoxic environment(5% oxygen).The changes of the number of fibroblasts after the silence of HIF-1α by HIF-1α shRNA virus using flow cytometer.ResultsThe Real time PCR and Western blot results showed that the expressions of HIF-1α mRNA and protein in fibroblasts of pathological scar was significantly higher than that in normal tissue(P<0.05),and the activity of the keloid fibroblasts in hypoxia environment(5%,2% and 1%)was also higher than that in normal tissue(P<0.05).The expressions of HIF-1α mRNA and protein in keloid fiber cells were higher in hypoxia environment(5% oxygen)than those in normal environment(20% oxygen),but when silence the expression of HIF-1α in keloid fibroblasts,the apoptosis of fibroblast in hypoxia environment(5% oxygen)were significantly higher than control group[(0.021±0.001)% vs.(3.739±0.039)%,P<0.05].ConclusionHIF-1α increases significantly in the pathological keloid fibroblasts and could promote the proliferation of fibroblasts and its vitality,which could accelerate the formation of pathological scar.

HIF-1α;pathological scar;fibroblast;proliferation

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.08.009

胡强，通信作者，男，博士，副主任医师，研究方向：皮肤烧伤，E-mail：huqiang92@126.com。

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