利用HaCaT细胞构建新型组织工程皮肤检测模型

李　燕,周宙霖,卢　涛,李瑞欣



利用HaCaT细胞构建新型组织工程皮肤检测模型

李燕1,2,周宙霖1,3,卢涛1,李瑞欣4

1.300162天津,武警后勤学院附属医院； 2.063000唐山,华北理工大学；3.510800广州,武警8730部队医院；4.300161天津,军事医学科学院卫生装备研究所

【摘要】目的构建以人永生化角质形成细胞HaCaT为种子细胞的组织工程皮肤模型。方法以丝素蛋白修饰聚酯聚酰胺无纺布为支架，以人永生化角质形成细胞和成纤维细胞为种子细胞，构建检测用的新型组织工程皮肤模型。选取10 种化学品作为检测物质，局部接触皮肤模型表面15 min，应用MTT 比色法测定细胞相对活力。结果3个不同批次的模型中，根据相对细胞活力值作为判定，构建的新型检测模型能够判断出8种化学品的刺激性，加入IL-1α试验后提高了模型的准确性，准确率达到75%。结论这个新的体外模型提供了有效的试验结果并证明了模型的可行性。同时它应该使用更多数量的物质进行进一步的验证，并测试在不同的实验室以适当评估重现性。

【关键词】HaCaT细胞；组织工程皮肤；丝素蛋白；刺激性；化学品

皮肤刺激被定义为试验物质作用于皮肤长达4 h的可逆性损害，一般无免疫系统的参与。化学品的潜在危害引起的急性皮肤刺激作为评估其基本毒理学方案的一部分[1]。在以往的研究中，对化学品潜在危害的评价进行了皮肤刺激试验，其中动物实验最为多见，而对兔Draize皮肤刺激试验应用最广。尽管此法使研究者普遍接受，但是兔和人类的刺激性之间的相关性还一直受到质疑，主要差异是兔的皮肤反应对于测试物有较高易感性，这可能是由于在人类和兔之间皮肤结构的差异[2]。因此，欧洲中心替代方法验证(ECVAM)科学咨询委员会，成立了以确保替代方法符合科学的监管部门。一些替代实验的开发，来确定化学物质对皮肤的刺激潜力，其中EpiSkin、EpiDerm和SkinEthic体外皮肤模型已经成功替代兔子的Draize试验[3]。随着2013-03欧盟全面禁止销售用动物进行试验检测的化妆品，我国也开始进行体外模型的研究[4,5]。本实验尝试构建了一种新的组织工程皮肤模型作为检测化学品刺激性的工具。

1材料与方法

1.1材料DMEM低糖培养液、DMEM 高糖培养液(Hyclone公司)、胰酶采用美国Gibco公司产品，胎牛血清、蚕丝、十二烷基硫酸钠(Sigma公司) 、氢氧化钾(TCI公司) 、D-柠檬烯(TCI公司) 、庚醛(TCI公司) 、1-溴己烷(TCI公司) 、3，3-二硫代二丙酸(TCI公司) 、3-氯硝基苯(TCI公司) 、4-甲硫基苯甲醛(TCI公司) 、1-溴-4-氯丁烷(TCI公司)、苯氧乙酸烯丙酯(TCI公司) 、异丙醇(TCI公司) 。以上化学物质根据欧洲中心替代方法验证 (European centre for the validation of alternative methods，ECVAM) 评价，从Episkin检测性能的化学品中选取的10种[6], 均为化学纯试剂。

1.2方法

1.2.1细胞培养取人永生化角质细胞株HaCaT细胞( 天津长征医院研究所惠赠) 用含血清的DMEM高糖培养液培养，成纤维细胞用含血清的DMEM低糖培养液培养，放于37 ℃、5% CO2孵箱，培养瓶内贴壁生长，胰酶消化传代。取指数生长期细胞备用。

1.2.2组织工程皮肤模型的制备(1)从蚕丝中提取丝素蛋白[7-9]，来修饰聚酯聚酰胺无纺布，将其作为皮肤模型的生物支架，干燥、高温灭菌后备用。(2)将对数生长期的HaCaT细胞和成纤维细胞以1×106个/ml接种于上述构建完成的支架上，在24孔板中于37 ℃、5% CO2孵箱内孵育3 d，然后在空气-液体界面培养13 d，从而培养成组织皮肤模型。

1.2.3测试化学品根据ECVAM标准中的试验化学品选取10种化学品(5种非刺激性试剂，5种刺激性试剂)，参照Episkin模型的检测方法进行试验[6]：(1)液体或粘性化学(25 μl)溶液，然后施加到组织工程皮肤模型的表面上。固体的化学品(25 mg)加25 μl的蒸馏水或者用微抹刀小心施加并轻轻涂抹在皮肤模型表面，每种化学品涂布在一式三份的组织。(2)此外，3个阴性对照组加入25 μl的蒸馏水，在皮肤模型上加5%的十二烷基硫酸钠作为阳性对照。(3)接触15 min后，小心地用PBS冲洗皮肤模型表面的试验化学品10次(尽可能除去剩余化学物质)。(4)将模型转移至新的24孔板内并每孔加入新鲜培养液1 ml，放入37 ℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中孵育42 h。(5)吸去培养液，加入0.5 ml的新配制的MTT溶液(1 mg/ml)，在37 ℃、5%CO2、饱和湿度的条件下培养3 h。(6)PBS冲洗模型后，放入装有0.3 ml异丙醇的玻璃管内震荡混匀，在室温下静置18 h。(7)每管200 μl萃取液移至96孔板中，以异丙醇作为空白对照，在570 nm的吸光度下测量OD值。(8)收集刺激试验后孵育42 h的条件培养液，检测它所释放的IL-1α的浓度，利用ELISA kit(北京四正柏)试剂盒进行检测。

2结果

2.1组织工程皮肤模型的形态学观察构建的组织工程皮肤经历13 d的气-液面培养后，HE染色如图1，结果显示组织工程皮肤模型分层较多，细胞数量密集，能够形成大约15个细胞层次的表皮结构，与正常皮肤的细胞层次非常接近。

图1　组织工程皮肤模型(HE，×400)

2.2化学品检测根据欧盟分类方案，本实验进行了10种化学品的刺激试验，其中5种刺激物和5种非刺激物，每一种化学品分为3组，其中包括阴性对照和阳性对照(表1)，以平均细胞相对活力百分数作为评判化学品刺激性的标准。根据Episkin检测标准用于检测验收的必须具备以下条件，阴性对照组的OD57O值必须为0.6～0.9，阳性对照(50%SDS)的细胞活力百分比为0%～20%，而化学品刺激性潜能的预测是基于相同的预测模型的细胞相对活力的结果：如果细胞相对活力<50%时，化学品被判断为刺激物，标记为I，细胞相对活力>50%时，化学品分类为非刺激物，标记为NI。IL-1α≥60 pg时，化学品判断为刺激性，标记为I，IL-1α<60 pg时，化学品判断为非刺激性，标记为NI。在10种化学物质中，十二烷基硫酸钠、氢氧化钾、D-柠檬烯、庚醛、1-溴己烷为刺激物(I)，3，3-二硫代二丙酸、3-氯硝基苯、4-甲硫基苯甲醛、1-溴-4-氯丁烷、苯氧乙酸烯丙酯为非刺激物(NI)。每个测试物进行三组不同批次的独立操作，其中D-柠檬烯，4-甲硫基苯甲醛与实际结果不同。刺激物D-柠檬烯错误判断为非刺激性的，而非刺激物4-甲硫基苯甲醛判断为刺激性的。而IL-1α作为皮肤受到刺激产生炎性反应后所释放的关键细胞因子。为了对模型进行评估，对条件培养液进行了IL-1α的释放检测。在试验结果，1-溴己烷被判断为非刺激性，4-甲硫基苯甲醛被判断为非刺激性，其他化学品的检测与MTT分析结果一致,总体准确度为75%。

表1　皮肤刺激性测试细胞活力判断　±s)

注：I=irritant(刺激性), NI=non-irritant(非刺激性)

3讨论

皮肤刺激试验早期多进行人4 h斑贴试验和动物实验，由于其违反伦理学等原因现已经很少使用。体外模型的制备无疑成了研究的重点。根据ECVAM性能标准[10，11]，皮肤模型必须有一个合适的屏障功能，以用于皮肤刺激试验，也就是说，它的角质层和脂质组合物应足以抵抗的细胞毒性标志物的化学品如SLS或Triton X-100的迅速渗透。本实验选用IC50的测定来评价屏障功能。

为了成功构建组织工程皮肤模型，支架和种子细胞的来源成了重要研究内容。本实验的丝素蛋白作为支架组成，其具有良好的生物相容性和吸附作用，能使在体外培养的细胞生长良好并且维持其特定的功能。根据丝素蛋白可控的降解性定制一定的年限，从而不仅保证了细胞的生长空间同时也使材料的耗损降到最低[7-9，12，13]。HaCaT细胞株来自人的正常皮肤，经过人乳头瘤病毒转染形成的永生化角质形成细胞[14]。近年来，HaCaT细胞常用于为化学品毒性和光毒性的检测[15，16]，从中可以看出与原代细胞相比，不受来源和批次的影响。

本实验在检测模型时选用了ECVAM性能标准中的MTT和细胞炎性反应因子进行测定，以细胞活力值为标准。MTT结果表明，十二烷基硫酸钠、氢氧化钾、庚醛、1-溴己烷、3，3-二硫代二丙酸、3-氯硝基苯、1-溴-4-氯丁烷、苯氧乙酸烯丙酯与欧盟实际分类一致，而D-柠檬烯、4-甲硫基苯甲醛得到了错误地判断，刺激性的D-柠檬烯判断为非刺激性的，非刺激性的4-甲硫基苯甲醛判断为刺激性的。而结合IL-1α试验提高模型的准确度，其中4-甲硫基苯甲醛在MTT分析出现错误的判断，但MTT和IL-1α试验中的4-甲硫基苯甲醛得到了正确的判断，从而准确率达到了75%。

与Episkin皮肤模型的评价结果相比，本实验的组织工程模型敏感性较低，准确性也与其有一定的差距。可能与本实验测试的化学品种类较少且不同组之间的检测结果也有较大的差异有关，下一步还将对本实验构建的模型进行改进。同时还将开展实验室内评价、实验室间评价、实验数据库开发、实验方法评价四个阶段的研究, 来进一步验证该组织工程皮肤用于化学品刺激性检测的可靠性。

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(2015-11-22收稿2016-02-29修回)

(责任编辑郭青)

基金项目：天津市自然科学基金面上项目(14JCYBJC29200)

作者简介：李燕，硕士研究生。 通讯作者：卢涛，E-mail:48144051@qq.com；李瑞欣，E-mail:liruixinxin@163.com

【中国图书分类号】R758.29

Construction of a new tissue engineering skin detection model using HaCaT cells

LI Yan1,2, ZHOU Zhoulin1,3, LU Tao1,and LI Ruixin4.

1.Department of Dermatology, The Armed Police Hospital of Tianjin, Tianjin 300162, China; 2.North China University of Science and Technology, Tangshan 063000, China;3.Hospital of Chinese People’s Armed Police Force 8730 Army, Guangzhou 510800, China;4.Academy of Military Medical Sciences, Tianjin 300161, China

【Abstract】ObjectiveTo construct human immortalized keratinocytes HaCaT as seed cells for tissue engineering skin model.MethodsA novel tissue engineered skin model was constructed for the detection of human immortalized keratinocytes and fibroblasts as seed cells. 10 kinds of chemicals were selected as test materials, the surface of local contact skin model was 15 min, and the relative viability of cells was measured by MTT colorimetry.ResultsThree different batches of the model, based on the relative values of cell viability as a decision, the new detection model constructed could determine eight kinds of harsh chemicals,after addition of IL-1α experiment improved the accuracy of the model, the accuracy rate was 75%.ConclusionsThis new model provides an effective in vitro test results and prove the feasibility of the model. At the same time it should use a greater number of substances for further validation and tests in different lab oratories to properly assess reproducibility.

【Key words】HaCaT cells; tissue-engineered skin; fibroin; irritant; chemicals