叶片山海绵水溶性活性产物的大孔吸附树脂分离及其抗肿瘤活性

贺腾飞，罗联忠，陈　军*，王德祥，丁少雄

(1.厦门大学海洋与地球学院，福建厦门361102;2.厦门医学院药学系，福建厦门361005)



叶片山海绵水溶性活性产物的大孔吸附树脂分离及其抗肿瘤活性

贺腾飞1，罗联忠2，陈军1*，王德祥1，丁少雄1

(1.厦门大学海洋与地球学院，福建厦门361102;2.厦门医学院药学系，福建厦门361005)

摘要：海绵拥有丰富的生物活性产物，以叶片山海绵(Mycale phyllophila)为材料，建立了以DA201-C大孔吸附树脂为核心的从水提液中提取活性产物的方法.以Lowry法跟踪得率，此方法对小分子肽类的回收率约为57%；粗提物的主要成分为肽类，约占89%.细胞活性检测表明粗提物对C6神经胶质瘤细胞、A2780-CP卵巢癌顺铂耐药细胞和HepG2肝癌细胞具有明显的抑制作用.本工作为深入研究叶片山海绵水溶性活性产物中的抗肿瘤组分奠定了基础.

关键词：海绵；大孔吸附树脂；肽类；抗肿瘤活性

海绵属于多孔动物门(Porifera)，是最原始的多细胞动物.海绵拥有丰富的生物活性产物，在目前发现的20 000多种海洋天然活性产物中，有7 000多种来自海绵[1-2]，海绵作为最重要的海洋药源生物越来越为医药界所重视.目前发现的海绵活性产物绝大部分是通过有机萃取方法富集起来的，这种方法对亲水性较强的组分提取效率可能较低，而且一些组分尤其是肽类组分的生物活性也可能会在长时间的有机溶剂处理后丢失.叶片山海绵(MycalephyllophilaHentschel，1911)在福建沿海分布较为广泛，本课题组对其开展了种属鉴定、原位移植和生活史等研究工作[3-5].本研究以叶片山海绵为实验材料，建立了适合于水溶性活性产物尤其是小分子肽类的大孔吸附树脂富集方法，细胞活性检测证明了该方法获得的肽类粗提物具有明显的抗肿瘤活性.

1材料与方法

1.1材料

叶片山海绵采自福建省东山湾古雷附近的渔排，将海绵离心脱水后置于-80 ℃冰箱保存.

1.2海绵破碎和水提

称取冷冻干燥后的叶片山海绵380 g，高速粉碎机粉碎；4 ℃条件下，粉末浸泡于1.2 L水提液(10 mmol/L pH 7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)，1.5 μmol/L抑肽酶，20 μmol/L苯硫脲，1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF))中充分搅拌20 min.冰上超声破碎，输出功率100 W，运行5 s，停止15 s，总运行时间15 min；4 ℃，8 000g离心15 min；将沉淀重悬于1.2 L水提液中.如此反复重悬、超声、离心4次，得合并后的上清约4.5 L，Lowry法检测其中肽类的浓度.

1.3超滤

采用PALL Centramate超滤系统切向流过滤上述上清液，先以2个MWCO300K膜包(PALL，美国)并联过滤，滤过液再以2个MWCO1K膜包(PALL，美国)并联过滤.每级过滤的截留液体积剩余约200 mL时加入1 L纯水继续过滤，直至截留液剩余约200 mL.最终获得约6 L MWCO1K膜包滤过液，将其命名为组分1，Lowry法检测肽类浓度.

1.4大孔吸附树脂富集水溶性活性产物

1.4.1评价4种大孔吸附树脂对水溶性肽类的静态吸附-解吸附效率

按照说明书处理4种大孔吸附树脂：DA201-C、AB-8、D101和NKA-9(均购自郑州勤实科技有限公司)；各取10 mL 树脂与50 mL 组分1混合，4 ℃层析柜中摇床震荡；在混合后2,4,6，16 h各取50 μL上清用Lowry法测定肽类浓度；16 h后去上清，纯水洗涤5次，抽干液体，加10 mL 70%(体积分数，下同)乙醇，震荡2 h，Lowry法测定溶液的肽类浓度.重复3次，计算静态吸附率和解吸附率.

1.4.2富集叶片山海绵水溶性活性产物

4 ℃层析柜中，将剩余约5 L 组分1与1.5 kg DA201-C大孔吸附树脂搅拌混合12 h；纯水漂洗5次后将树脂装入直径5.5 cm、高100 cm的层析柱并连入AKATA蛋白纯化仪(GE，美国)，检测A280信号峰；用纯水以流速5 mL/min洗涤直至电导率接近于0；用70%乙醇以流速5 mL/min洗脱，收集洗脱峰，Lowry法检测肽类浓度；洗脱组分旋转蒸发除乙醇，冷冻干燥，称量.以10 mmol/L PBS(pH 7.4)配制500 μg/mL粗提物溶液用于细胞活性检测.

1.5肿瘤细胞显微观察

C6神经胶质瘤细胞、A2780-CP卵巢癌顺铂耐药细胞和HepG2肝癌细胞由厦门市中山医院赠送.细胞培养液为含10%(体积分数)小牛血清的DMEM细胞培养液(Gibco)，细胞置于5%(体积分数)CO2培养箱内37 ℃培养，每2～3 d传代一次.细胞活性检测：向180 μL的对数生长期细胞中加入20 μL粗提物溶液或负对照(10 mmol/L pH 7.4的PBS)，培养12 h后在倒置显微镜(Leica DMil)下观察细胞形态变化.

2结果

2.14种大孔吸附树脂对海绵水溶性肽类的静态吸附-解吸附效率

海绵水提液超滤后的体积很大，如何高效地对样品浓缩和脱盐成为首要任务.为提高水溶性活性组分的综合回收效率，本实验以肽类为检测指标，测试了4种不同大孔吸附树脂对肽类的静态吸附率和解吸附率，结果如图1所示.其中DA201-C对肽类在静态吸附率、解吸附率和吸附稳定性上有明显的综合优势.以吸附2 h为例，DA201-C具有最高的静态吸附率(约68%)和最高的解吸附率(约63%)，其综合回收效率约43%，高于AB-8(约32%)、D101(约23%)和NKA-9(约8%)；且DA201-C大孔吸附树脂对肽类吸附2 h后达到吸附平台，之后吸附率保持稳定.由此可见，DA201-C大孔吸附树脂对肽类有综合回收效率高和吸附稳定的特点，适用于完成较大规模的吸附实验.

图1　4种大孔吸附树脂对海绵水溶性 肽类的静态吸附率(a)和静态解吸附率(b)Fig.1The adsorption (a) and desorption (b) properties of four macroporous resin types

2.2DA201-C大孔吸附树脂的洗脱曲线

组分1与DA201-C大孔吸附树脂搅拌混合过夜后，将吸附了肽类的树脂装入层析系统，洗脱曲线如图2所示.共收集得到2～5 L区间的约3 L浅黄色解吸液，Lowry法测得其中含肽类总质量约8.01 g.解吸液旋转蒸发，冷冻干燥得9.01 g粗提物干粉.

2.3水溶性肽类在提取流程各阶段的得率

叶片山海绵在不同提取阶段的得率见表1.本流程的出膏率约为2.4%，即从1 kg干质量的海绵能获得大约24 g的粗提物，此粗提物主要成分为小分子肽类，占比约为89%.

检测波长280 nm.图2　DA201-C型大孔树脂对肽类的动态解吸曲线Fig.2The dynamic desorption curve of DA201-C macroporous resin

2.4粗提物对肿瘤细胞活性的抑制作用

将粗提物以50 μg/mL的终质量浓度加入到C6、A2780-CP和HepG2 3种肿瘤细胞中，并在12 h后于倒置显微镜下观察，结果如图3所示.PBS对照组的C6细胞呈梭形，贴壁生长，胞质丰富且透明，细胞核相

表1　肽类在不同提取阶段的得率Tab.1　Yields of peptides at different extraction stages

对较大，细胞间黏连完好，单层排列密集；经过粗提物处理的C6细胞呈圆形，细胞数量明显减少，细胞发生皱缩，胞浆出现“发芽”结构，其体积明显减小，细胞间连接变少(图3(a)和(b)).PBS对照组的A2780-CP细胞呈团状贴壁生长，细胞黏连较好，细胞体积较大，胞质丰富且均匀；而经过粗提物处理后的A2780-CP细胞体积显著减小，细胞核固缩明显，胞浆出现许多大小不一的空泡结构，细胞连接较少，数量也显著地减少(图3(c)和(d)).PBS对照组的HepG2细胞为梭形，贴壁生长，大小较一致;而经粗提物处理后的HepG2细胞变圆，细胞核等结构发生明显的偏移，均集中在细胞的一侧，而细胞膜完整(图3(e)和(f)).由此可见，海绵的肽类粗提物对C6、A2780-CP和HepG2细胞的形态结构影响显著，且细胞数量减少，证明该粗提物可以抑制这3种肿瘤细胞的生长，有明显的抗肿瘤活性.

对照组：(a)C6细胞，(c)A2780-CP细胞，(e)HepG2细胞； 粗提物处理组(12 h)：(b)C6细胞， (d)A2780-CP细胞，(f)HepG2细胞.图3　叶片山海绵粗提物处理后肿瘤细胞的显微形态变化Fig.3Morphological changes of tumor cells by treatment with sponge extracts

3讨论

肽类具有分子质量小、无免疫原性、结构简单和副作用小等特点，具有很高的开发价值.海绵也拥有丰富的肽类或其衍生的活性产物，比如海绵来源的三肽化合物Hemiasterlin是微管蛋白的解聚物，能诱导有丝分裂阻滞和细胞凋亡，具有良好的开发为抗癌药物的潜力[6]；从蒂壳海绵属Theonellasp.中分离得到双环肽类Theonellamide A～F，有强烈的抗真菌活性[7].但是已发现的海绵活性肽类主要是通过有机萃取获得的，通常与其他类别的化合物混杂在一起，目前还没有一个系统富集海绵肽类的方法，肽的种类、分离效率和规模受到限制.建立一种系统富集小分子肽类的方法是本研究的关注点.

本方法首先通过超滤去除大分子，再利用大孔吸附树脂富集水溶性小分子肽类.小分子肽类的提取难点在于脱盐，许多寡肽和环肽的相对分子质量小于1 000，很难与水溶液中的盐类分开.前期试验了凝胶过滤、纳滤、固相萃取和离子交换等方法脱盐，但这些方法由于通量低、成本高、耗时长或吸附率低等原因，对升以上规模的操作困难极大.多个文献报道了大孔吸附树脂对某些肽类有良好的吸附特性[8-10]，可以应用于肽类水溶液的脱盐.但由于肽类结构繁多，理化性质多样，特定树脂并不能把水溶液中的所有不同种类的肽类都吸附下来.本研究先测定了4种适用于肽类吸附的大孔吸附树脂对海绵水提液肽类的静态吸附率和解吸附率，确定了DA201-C大孔吸附树脂具有最高的综合回收效率；再通过动态解吸附，对水提液中肽类的总回收效率达到57%.整个脱盐流程耗时仅1 d，具有成本低、耗时少、通量高和易放大等优点.

粗提物对3种肿瘤细胞明显的抑制作用表明了本研究的提取方法有效地保留了小分子肽类的生物活性.虽然粗提物的细胞毒活性浓度处于中等水平，但通过进一步的分离纯化，有望追踪获得活性更高的组分；而且通过更广泛的活性筛选，比如抗氧化、抗菌和抗病毒等活性筛选模型，很可能会从中发现新的活性.优化的小分子肽类富集方法为后续的小分子肽类活性研究，包括更广泛的活性筛选、活性组分的精细分离、结构测定和活性机理研究等工作奠定了坚实的基础.

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doi：10.6043/j.issn.0438-0479.201508019

收稿日期：2015-08-26录用日期：2015-11-16

基金项目：厦门南方海洋研究中心项目(13GYY002NF07)

*通信作者：chenjun@xmu.edu.cn

中图分类号:P 745

文献标志码：A

文章编号：0438-0479(2016)04-0506-04

The Enrichment Product from Sponge Mycale phyllophila Water Extract by a Macroporous Resin and Its Anti-tumor Activity

HE Tenfei1，LUO Lianzhong2，CHEN Jun1*，WANG Dexiang1，DING Shaoxiong1

(1.College of Ocean & Earth Sciences，Xiamen University，Xiamen 361102，China;2.Department of Pharmacy,Xiamen Medical College，Xiaman 361005，China)

Abstract:Marine sponges contain abundant bioactive compounds.This study established a method that a DA201-C macroporous adsorption resin was used to enrich bioactive products from Mycale phyllophila water extract.Lowry′s assay showed that this method recovered about 57% of the total small molecular peptides from the water extract.The majority compounds of the enrichment product are peptides，accounting for about 89%.In addition，the enriched product has obvious inhibitory activities to C6 glioma cells，A2780-CP ovarian cancer cisplatin-resistant cells and HepG2 hepatoma cells.This study lays the foundation for in-depth study on the anti-tumor compound from M. phyllophila water extract.

Key words:marine sponge;macroporous adsorption resin;peptide;anti-tumor activity

引文格式：贺腾飞，罗联忠，陈军，等.叶片山海绵水溶性活性产物的大孔吸附树脂分离及其抗肿瘤活性[J].厦门大学学报(自然科学版)，2016,55(4)：506-509.

Citation：HE T F，LUO L Z，CHEN J,et al．The enrichment product from spongeMycalephyllophilawater extract by a macroporous resin and its anti-tumor activity[J].Journal of Xiamen University(Natural Science)，2016,55(4)：506-509．(in Chinese)