胰岛素穴位缓释注射对SD大鼠不同时间降糖效应的影响

周慧，贾延涛，张江松，林咸明（浙江中医药大学，杭州 310053）



·动物实验·

胰岛素穴位缓释注射对SD大鼠不同时间降糖效应的影响

周慧，贾延涛，张江松，林咸明
（浙江中医药大学，杭州 310053）

【摘要】目的观察胰岛素结合PVP缓释剂穴位注射对SD大鼠不同时间血糖值、血清胰岛素含量变化并分析其相关性。方法将144只SD雄性大鼠随机分为A组（单纯胰岛素穴注组）、B组（胰岛素穴注缓释组）和C组（对照组）。各组以40%葡萄糖（剂量为2.2 g/kg）灌胃1 h后，A组和B组进行足三里穴位注射，C组不予处理。3组分别于穴位注射后0.5 h、3 h、6 h、8 h、10 h和24 h 6个时间点测定大鼠血糖值及血清胰岛素含量（C组按相应时点取血测定）；同时在穴位注射后3 h、10 h、24 h 3个时间点采用光镜观察各组大鼠足三里穴区组织刺激反应。结果A组和B组降糖率均在穴位注射后3 h到达高峰后逐渐下降。A组在穴位注射后6 h降糖作用趋于稳定，B组在穴位注射后10 h趋于稳定，且B组在穴位注射后6 h与8 h的降糖作用明显优于A组（P＜0.01）。A组血清胰岛素在穴位注射后3 h到达高峰（P＜0.05），至6 h趋于稳定。B组在穴位注射后0.5 h、3 h、6 h、8 h 4个时间点血清胰岛素含量均显著低于A组（P＜0.05）。大鼠血清胰岛素含量与降糖率相关性分析显示，A组存在显著正相关（P＜0.01），B组存在低度正相关（P＜0.05）。穴位注射后3h、8 h、24 h 3个时间点A组和B组大鼠足三里穴区周围肌纤维组织横纹清晰、结构完整，无明显变性、坏死和炎性反应，与C组比较无明显病理变化。结论PVP缓释剂可减缓胰岛素在大鼠足三里穴区的吸收速率，同时延长了胰岛素降糖效应持续时间，而且显示血清胰岛素含量与降糖效应的相关性降低，提示穴位注射缓释技术可以延长药物穴位注射效应。

【关键词】水针；缓释技术；胰岛素；降糖作用；聚乙烯吡咯烷酮；大鼠

药物缓释（或控释）技术是当今给药技术的新方法，目前已有一些成熟的药物控释制剂应用于临床［1］，其优点一是可减少注射次数，提高患者的依从性；二是保持稳定的血药浓度，避免了峰谷现象，降低了药物的不良反应。但目前在穴位注射领域药物缓释（或控释）技术的研究和应用还少见报道，所以对穴位注射结合药物缓释技术影响穴位注射药物在穴区维持作用的时间长短与其总体效应的相关性进行研究，以及对穴位缓释剂注射的穴效药效整合机制方面进行探索具有重要意义。

目前，药物穴位注射有大量的临床使用度，但对其深入研究较少，特别是药物在穴区的吸收速率对其效应的影响未见报道。如何减缓药物在穴位内的吸收速率，使药物对穴位的化学性刺激反应延长，从而更好地激发经气，使药物通过经络-腧穴系统的传导而发挥更佳治疗效应，是提高药物穴注疗法疗效的一个重要方面［2］。故本实验采用穴位注射结合药物缓释技术，将聚乙烯吡咯烷酮（PVP）制备成胰岛素缓释剂［3］，研究胰岛素结合缓释剂穴位注射对SD大鼠血糖及血清胰岛素含量及观察对穴区组织的影响，试对药物穴位注射进行改良，现报告如下。

1　材料与方法

1.1实验动物

Sprague-Dawley（SD）大鼠144只，雄性，清洁级，体重为（200±20）g，由中科院上海实验动物中心提供，饲养于学校实验动物中心，给予啮齿类动物标准颗粒饲料及饮水，实验室适应性喂养5 d后进行实验。

1.2主要仪器及试剂

罗氏血糖测定仪（德国罗氏公司，批号2189）；多功能酶标分析仪（德国Thermo公司，批号609464）。

血清胰岛素酶联免疫试剂盒（Sigma进口分装，美国，BPE10552R）；胰岛素注射液（诺和灵，规格400 U/ 10 mL，1003222）；聚乙烯吡咯烷酮（达文生物，杭州，0507-100G）。

1.3干预方法

采用随机数字表分配法将SD大鼠随机分为A组（单纯胰岛素穴注组）、B组（胰岛素穴注缓释组）和C组（对照组）。各组大鼠以40%葡萄糖（按2.2 g/kg剂量［4］）进行灌胃，1 h后各组处理如下。A组取双侧大鼠“足三里”（定位参照华兴邦等［5］定位法）进行穴位注射胰岛素（胰岛素注射液与生理盐水按1：1稀释至200 U/10 mL，每只大鼠按胰岛素5 U/kg剂量（即0.25 mL/kg）分双侧穴位等量注射）。B组取双侧“足三里”进行穴位注射胰岛素缓释液（胰岛素注射液与生理盐水按1：1稀释至200 U/10 mL，取10 g PVP加入胰岛素注射液稀释液充分混匀定容到100 mL，经0.45 μm、0.22 μm一次性滤膜抽滤除菌配制成胰岛素缓释液，每只大鼠按胰岛素5 U/kg剂量（即0.25 mL/kg）分双侧穴位等量注射）。C组葡萄糖灌胃后不予任何处理。

1.4检测指标及方法

1.4.1血糖、血清胰岛素含量的检测

分别于穴位注射后0.5 h、3 h、6 h、8 h、10 h 和24 h 6个时间点，各组大鼠剪尾法取血后，利用罗氏血糖仪检测血糖值（C组按相应时点取血测定），并根据以下公式计算处理不同时间点各组大鼠血糖下降百分率，血糖下降百分率＝［（给药前血糖值－给药后血糖值）/给药前血糖值］×100%。待血糖值检测完毕后，各组大鼠采用5 mL注射器采集静脉血（腹腔静脉取血约4 mL/只），利用酶联免疫法（ELISA）检测各组大鼠血清胰岛素的含量。

1.4.2穴位注射周围组织的刺激性实验

取穴位注射后3 h、10 h、24 h 3个时间点的各组大鼠，待静脉血采集完毕后，解剖取出双侧足三里穴位周围组织，C组同时间点做相同处理。肉眼观察各组穴注周围局部刺激反应后，采用10%福尔马林进行组织固定、脱水、包埋。5 μm连续切片，HE染色，显微镜观察各组肌纤维组织横纹是否清晰、结构是否完整，有无变性、坏死和炎性反应。

1.5统计学方法

所有数据采用SPSS 17.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差表示，多组间计量资料比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），组间两两比较，方差齐性时用LSD检验，方差不齐时用Dunnett-T3检验；计数资料采用卡方检验。以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2　实验结果

2.1各组不同时间点降糖率比较

由表1可见，A组和B组同一时间点均表现出较强的降糖作用，与C组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。A组的降糖作用在穴位注射后3 h到达高峰后逐渐下降，在穴位注射后6 h降糖作用趋于稳定，穴位注射6 h之前相邻2个时间点比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）。B组降糖作用同样在穴位注射后3 h到达高峰，但是其降糖作用却延长至穴位注射后10 h才趋于稳定，穴位注射10 h之前相邻2个时间点比较，差异均有统计学意义（P＜0.01），且穴位注射后6 h、8 h的降糖作用明显强于A组，差异均具有统计学意义（P＜0.01），提示PVP缓释剂延长了胰岛素的降糖作用。

表1　各组不同时间点降糖率比较（±s,%）

表1　各组不同时间点降糖率比较（±s,%）

注： 与C 组比较1）P＜0.01；与A 组比较2）P＜0.01；与同组前1 个时间点比较3）P＜0.01

组别　0.5 h（n=8）　3 h（n=8）　6 h（n=8）　8 h（n=8）　10 h（n=8）　24 h（n=8）A组　63.7±1.41）　86.2±1.01）3）　38.2±4.21）3）　33.5±3.41）　35.5±1.71）　37.5±1.61）B组　59.7±1.41）　85.2±0.71）3）　66.2±2.71）2）3）　49.2±3.21）2）3）　34.5±2.41）3）　33.8±2.11）C组　9.9±1.6　18.2±1.7　23.1±3.5　19.4±1.4　20.5±1.7　24.2±1.1

2.2各组不同时间点血清胰岛素浓度比较

由表2可见，A组和B组同一时间点血清胰岛素含量显著高于C组，差异均具有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05）。A组血清胰岛素的含量变化较为明显，在穴位注射后3 h到达高峰，之后随着时间的延长血清胰岛素含量逐渐下降，至6 h逐渐趋于稳定。B组血清胰岛素含量变化无明显的峰值出现，且穴位注射后0.5 h、3 h、6 h、8 h 4个时间点的血清胰岛素含量均显著低于A组，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。

表2　各组不同时间点血清胰岛素浓度比较（±s,mU/L）

表2　各组不同时间点血清胰岛素浓度比较（±s,mU/L）

注：与C组比较1）P＜0.01，2）P＜0.05；与A组比较3）P＜0.01，4）P＜0.05；与同组前1个时间点比较5）P＜0.05

组别　0.5 h（n=8）　3 h（n=8）　6 h（n=8）　8 h（n=8）　10 h（n=8）　24 h（n=8）A组　6.058±0.3812）　8.763±0.6001）5）　6.572±0.3181）5）　5.779±0.3501）　5.275±0.5871）　4.592±0.2921）B组　5.075±0.3044）　5.384±0.1543）　4.996±0.1752）3）　4.918±0.1302）4）　4.910±0.0502）　4.831±0.1441）C组　4.947±0.103　4.634±0.234　4.271±0.145　3.976±0.233　3.812±0.081　3.685±0.118

2.3各组大鼠血清胰岛素含量与降糖率相关性分析结果

由表3可见，将各组大鼠不同时间点的血清胰岛素含量与降糖率（小数表示）进行直线相关分析，结果显示，A组大鼠血清胰岛素含量与降糖率之间存在显著正相关（P＜0.01）；B组大鼠血清胰岛素含量与降糖率之间存在低度正相关（P＜0.05）；C组大鼠血清胰岛素含量与降糖率之间并无明显相关性（P＞0.05）。

表3　各组大鼠血清胰岛素含量与降糖率相关性分析结果

2.4各组不同时间点大鼠“足三里”穴区组织刺激性实验结果

2.4.1组织病理检查

由图1～3可见，穴位注射后3 h、10 h、24 h 3个时间点的各组大鼠“足三里”穴区肌纤维组织横纹清晰、结构完整，无明显变性、坏死和炎性反应，与A组比较无明显病理变化，表明本实验所采用的胰岛素穴注缓释技术对穴注周围组织无明显损害性刺激作用。

2.4.2各组大鼠“足三里”穴区组织刺激反应

肉眼观察在穴位注射后3 h、10 h、24 h 3个时间点各组大鼠“足三里”穴区组织刺激反应，用刺激度［刺激度＝（阳性例数/总例数）×100%］表示。由表4可见，A组、B组和C组穴位注射后3 h、10 h、24 h 3个时间点的周围组织刺激性反应均无显著性差异（P＞0.05）。

图1　3 h穴位注射周围组织光镜观察结果（HE染色×40）

图2　10 h穴位注射周围组织光镜观察结果（HE染色×40）

图3　24 h穴位注射周围组织光镜观察结果（HE染色×40）

表4　各组不同时间点大鼠足三里穴周围肌肉刺激反应评级结果　（例）

3　讨论

穴位注射配合药物缓释技术具有穴效和药效的整合效应。在选穴适当的情况下，药液注入穴位后，因其占有一定空间对周围组织产生压力从而刺激局部感受器产生酸、麻、胀等“针感”样作用，以及药液本身固有的药理作用和药物缓释作用产生的持续的化学性刺激，均为穴位注射配合药物缓释技术发挥药效的基础，所以药物在穴位内作用持续时间的长短十分重要。Strudwick MW等［6］的研究表明，在同一穴位进行多次重复的注射可以明显增强药物对穴位的刺激。由此推测，利用药物缓释技术进行穴位注射，能获得穴效与药效的“整合效应”［7］，即在低血药浓度状态下获得药效的“高效性”，在少次小剂量穴位药物缓释注射下获得药效的“长效性”。

本实验对PVP混合胰岛素缓释穴位注射与胰岛素常规穴位注射在穴位注射0.5 h、3 h、6 h、8 h、10 h和24 h 6个时间点的血清胰岛素、血糖水平进行同步观察。结果表明，穴注后0.5～8 h时间段B组血清胰岛素含量明显低于A组，但其降糖效应优于A组，表明药物穴位注射效应与血药浓度无明确相关性。

此外，A组在各时点血清胰岛素含量变化较大，与其降糖作用变化趋势相同，均在穴位注射后3 h达到高峰随即下降，至穴位注射6 h后血清胰岛素含量变化相对平稳，降糖作用也趋于稳定；而B组各时间点之间的血清胰岛素含量变化相对平稳，检测时点中均无明显峰值出现，其降糖作用则于穴位注射后3 h到达高峰，至穴位注射后10 h才趋于稳定，且穴位注射后6 h与8 h的降糖作用明显强于A组。根据上述实验结果分析，推测PVP缓释剂起到了缓释作用。而B组的这种降糖作用正是由于PVP以其独特的理化特性及生理惰性，延缓了胰岛素在穴区的释放时间和作用强度，从而增加了胰岛素对穴区的化学性刺激，产生出持久而有效的降糖作用［8］。

目前，PVP已作为助溶剂、分散剂及延效剂等广泛应用于可注射缓释剂中，因其有高度的分散性和稳定性，灭菌温度下不影响助悬等性质，常用做帮助主药混悬的附加剂及延效剂，且PVP制得的混悬液很稳定，组织中未见炎症及免疫排斥反应，具有良好的适应性及可注射性。本研究所采用的穴位注射结合药物缓释技术是对穴位注射疗法的一种改良试验，有其一定的开发和应用价值。

参考文献

［1］崔英德，易国斌，廖列文.聚乙烯吡咯烷酮的合成与应用［M］.北京：科学出版社，2001.

［2］贾延涛，刘建勋，林咸明.影响穴位注射效应相关因素分析及对策［J］.浙江中医药大学学报，2011，35（1）：126-127.

［3］韩永龙，宋铁兵，姚晓影.聚乙烯吡咯烷酮在中药制剂中的应用［J］.中医药学报，2008，36（4）：58-60.

［4］陈广，陆付耳，徐丽君.黄连解毒汤对2型糖尿病大鼠靶组织葡萄糖转运子4的影响［J］.中西医结合学报，2007，5（4）：412-415.

［5］华兴邦，李辞蓉，周浩良，等.大鼠穴位图谱的研制［J］.实验动物与动物实验，1991，（1）：1-5.

［6］Strudwick MW，Hinks RC，Choy ST.Point injection as an alternative acupuncture technique--an exploratory study of responses in healthy subjects［J］.Acupunct Med，2007，25（4）：166-174.

［7］诸毅晖，成词松，钟兰.从“穴位注射”研究看经络的“整合”功能［J］.成都中医药大学学报，2003，26（3）：60-61.

［8］徐兆喻.聚乙烯吡咯烷酮和N-甲基吡咯烷酮合成工艺和应用［J］.精细化工原料及中间体，2004，5（4）：33-37.

【中图分类号】R2-03

【文献标志码】A

DOI：10.13460/j.issn.1005-0957.2016.05.0608

文章编号：1005-0957（2016）05-0608-04

收稿日期2015-12-30

作者简介：周慧（1989-），女，2013级硕士生，Email：250855167@qq.com

通信作者：林咸明（1966-），男，教授，Email：linxianming66@126.com

Hypoglycemic Effect of Acupoint Injection of Sustained-release Insulin at Different Times in SD Rats

ZHOU Hui，JIA Yan-tao，ZHANG Jiang-son，LIN Xian-ming.
Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine，Hangzhou 310053，China

［Abstract］ObjectiveTo observe blood glucose values and serum insulin levels at different times after acupoint injection of insulin with PVP as a sustained release agent and analyze the correlation between them in SD Rats.MethodsOne hundred and forty-four male SD rats were randomized into groups A （acupoint injection of insulin alone），B（acupoint injection of sustained-release insulin）and C（control）.At one hour after every group received an oral gavage of 40%glucose solution（2.2 g/kg），groups A and B were given point Zusanli injection and group C was not treated.In the three groups of rats，blood glucose values and serum insulin levels were measured at six time points：0.5，3，6，8，10 and 24 hours after acupoint injection（in group C at the corresponding time points）.In every group，the reaction of Point Zusanli region to the stimulation was observed by optical microscopy in at three time points：3，10 and 24 hours after acupoint injection.ResultsThe glucose-lowering rate reached its peak at 3 hours after acupoint injection and then declined in groups A and B.The hypoglycemic effect tended to be stable at 6 hours after acupoint injection in group A and at 10 hours after acupoint injection in group B.The hypoglycemic effect was better in group B than in group A at 6 and 8 hours after acupoint injection（P＜0.01）.In group A，serum insulin reached its peak at 3 hours and tended to be stable at 6 hours after acupoint injection（P＜0.05）.Serum insulin levels were significantly lower in group B than in group A at four time pints：0.5，3，6 and 8 hours after acupoint injection（P＜0.05）.An analysis of the correlation between rat serum insulin levels and the glucose-lowering rate showed a significant positive correlation in group A（P＜0.01）and a low positive correlation in group B（P＜0.05）.In groups A and B of rats，clear stripes and complete structure of muscle fibers were seen with no obvious degeneration，necrosis and inflammatory reaction around point Zusanli at three time points：3，8 and 24 hours after acupoint injection；there were no obvious pathological changes compared with group C.ConclusionsPVP as a sustained release agent can slow down the absorption rate of insulin in rat point Zusanli region.Meanwhile，it prolongs the continuous time of the hypoglycemic effect of insulin.There is a low correlation between serum insulin levels and the hypoglycemic effect，suggesting that acupoint injection with a sustained release agent can prolong the effect of acupoint injection of medicine.

［Key words］Acupoint injection；Sustained-release technique；Insulin；Hypoglycemic effect；Polyvinylpyrrolidone；Rats