电针预处理对兔实验性脑血管痉挛的影响

陈品杰，王镇章，林超伟，陈勇，冯晓珍，陈冲，谢文霞（温州医科大学附属第一医院，温州 325000）



·动物实验·

电针预处理对兔实验性脑血管痉挛的影响

陈品杰，王镇章，林超伟，陈勇，冯晓珍，陈冲，谢文霞
（温州医科大学附属第一医院，温州 325000）

【摘要】目的观察电针对防治迟发性脑血管痉挛的影响。方法将16只健康日本大耳白兔随机分为治疗组和对照组，每组8只。治疗组在固定时间段每天 行经皮穴位电刺激20 min，第6天行肌肉麻醉后造模；对照组不给予电刺激，仅在第6天行肌肉麻醉后造模（同治疗组）。两组电针前与造模后分别行CTA检测基底动脉直径，并观察两组造模后血浆ET-1、CGRP 和IL-6的水平情况与造模后1 d、3 d、5 d的行为学变化情况。结果治疗组造模后基底动脉直径与对照组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。治疗组造模后血浆ET-1、CGRP和IL-6水平与对照组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。治疗组造模后3 d、5 d神经功能评分与同组造模后1 d比较，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。治疗组造模后3 d、5 d神经功能评分与对照组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。结论电针干预可能是通过对ET-1、CGRP和IL-6水平的调整，参与抗炎和免疫抑制，扩张血管，起到防治与改善迟发性脑血管痉挛作用。

【关键词】电针；脑血管痉挛；基底动脉；兔

症状性脑血管痉挛（symptomatic cerebral vasospasm，SCVS），是导致蛛网膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）患者预后不良的主要原因之一。大量文献资料和实验数据表明，SAH后脑血管痉挛（CVS）的发生率约为30%～70%，有20%～30%的患者在临床上表现出迟发型神经功能缺失，有15%～20%的患者因卒中致残或因缺血而死亡［1］。SAH后数日至两星期多发生脑血管持续性狭窄，造成所支配区域不同程度的缺血状态并引发一系列神经系统迟发性缺血症状，重者导致植物人甚至死亡，严重影响治疗效果和生存质量。

目前针对改善与预防CVS的方法主要是药物疗法和非药物疗法。临床研究中发现，电针能有效改善血管痉挛现象，解除与减轻相应的临床症状。因此，笔者拟通过家兔造模前行电针预处理实验，通过检测CVS家兔造模前后基底动脉直径和血浆内皮素-1（ET-1）、降钙素基因相关肽（CGRP）和白介素-6（IL-6）水平的变化，观察电针穴位刺激是否能改善与预防迟发性脑血管痉挛（DCVS）的发生，现报告如下。

1　材料与方法

1.1实验动物

纯种健康日本大耳白兔16只，雌雄不等，体重2.0～2.5 kg，由温州医科大学动物实验中心提供，实验室自然条件饲养。

1.2实验器材

数字显示隔水式电热恒温培养箱 （PYX-DHS，上海跃进医疗器械厂）、离心机 （TGL-168，上海安亭科学仪器厂）、漩涡混合器（XW-80A，上海青浦沪西仪器厂）、电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9023A，上海精宏实验设备有限公司）、电动组织匀浆器（美国KIMBLE）、注射器、韩式穴位电刺激仪（HANS-200E，南京济生医疗科学公司）及常规手术器械、留置针等。

1.3分组与处理

将16只日本大耳白兔随机分为治疗组（预处理组）和对照组，每组8只。

1.3.1治疗组

取双侧足三里、内关和风池穴。取穴参照《实验针灸学》［2］。将日本大耳白兔穿上自制兔衣后于固定架固定，穴区剪毛备皮，75%乙醇常规消毒后，采用0.25 mm×40 mm毫针进行针刺，进针3 mm后接韩式穴位电刺激仪，两侧风池为一组，同侧内关、足三里各为一组（内关接正极，足三里接负极）。将输出电极线改为普通电针仪电极线，刺激频率为2 Hz和100 Hz疏密交替波，强度为1 mA，留针20 min。每日在固定时间治疗1次，共治疗5 d。

1.3.2对照组

造模前不给予电针治疗，行常规饲养。

1.4模型制备

按照Chan等的枕大池二次注血法制造SAH后DCVS的动物模型。根据家兔体重，先用氯氨酮（25 mg/kg）、氯丙嗪（12.5 mg/kg）行肌肉注射来麻醉家兔，再将家兔颈背部备皮消毒，采取侧卧位，头颈背部垂直于操作台，尽量使其头部向胸部屈曲，左手触摸到枕骨突隆和寰椎翼后即枕骨大孔为穿刺点，持留置针（将针头磨钝）由凹陷正中（两乳突连线中点）平行于兔嘴方向刺入，进入延髓池后可感到针头无阻力，可见清亮液体，注入自身动脉血（1 mL/kg），将兔置于头低位30°，持续30 min，以利于注入的血液聚集于颅底。48 h后重复上述操作，注血量改为0.5 mL/kg［3-5］。在行CTA检查过程中发现蛛网膜下腔类似血凝块视为造模成功。

1.5观察检测

1.5.1基底动脉直径的测定

两组分别在电针前与造模后（第6天）进行CTA检查［6］。动物麻醉后，取正中俯卧位，使用美国 GE ughtspeed pro 16层螺旋CT扫描仪进行CTA检查，技术参数为厚1.25 mm，层间距1.0 mm，螺距0.562：1，扫描速度0.8 s/每转，电压80 kV，电流 100 mA，曝光时间9.3 s，视野9.6 cm。使用高压注射器经兔耳缘静脉注入造影剂7 mL，注射速度为0.4 mL/s，延时15 s开始扫描，范围起自枕骨粗隆至颅顶。扫描数据传至ADW4.2工作站，应用容积重建进行后处理。

1.5.2血浆ET-1、CGRP和IL-6的检测

在造模后经家兔中央动脉取动脉血1 mL，分别置于塑料试管中，用EDTA作为抗凝剂，标本采集后30 min内于2℃～8℃ 3000×g离心15 min，将标本放于-20℃保存（避免反复冻融），样品定期集中送检。运用生物素双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA）测定样品中兔ET-1、CGRP和IL-6的水平。向预先包被了ET-1、CGRP和IL-6单克隆抗体的酶标孔中加入ET-1、CGRP和IL-6，温育；温育后，加入生物素标记的抗ET-1、CGRP和IL-6抗体，再与链霉亲和素-HRP结合，形成免疫复合物，再经过温育和洗涤，去除未结合的酶，然后加入底物A、B，产生蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅与样品中兔ET-1、CGRP和IL-6的浓度呈正相关。用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品ET-1、CGRP和IL-6浓度。

1.5.3神经功能障碍的观察

每组家兔在造模后1 d、3 d、5 d进行行为学观察。按Endo S标准［7］，神经功能障碍运动分为4级计分。1分为无神经功能缺损（正常）；2分为轻度或者怀疑神经功能缺损（嗜睡、活动减少）；3分为中度神经功能缺损（肢体无力、跛行）；4分为重度神经功能缺损（划圈运动等行走困难）。

1.6统计学方法

采用SPASS 20.0统计分析软件，计量数据以均数±标准差表示，各组间差异统计用成组t检验，组内比较采用配对t检验。以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2　结果

2.1电针预处理对基底动脉直径的影响

3D-CTA显示对照组造模后基底动脉血管发生痉挛，直径较造模前明显狭窄（P＜0.05）。治疗组造模后基底动脉直径与对照组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。详见表1、图1。

表1　两组造模前后基底动脉直径比较　（±s,mm）

表1　两组造模前后基底动脉直径比较　（±s,mm）

注：与同组治疗前比较1）P＜0.05；与对照组比较2）P＜0.05

组别　n　造模前　造模后治疗组　8　1.24±0.52　1.25±0.132）对照组　8　1.21±0.12　1.03±0.141）

图1　两组造模前后基底动脉直径

2.2电针预处理对血浆ET-1、CGRP和IL-6水平的影响

治疗组造模后血浆ET-1、CGRP和IL-6水平与对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。详见表2。

表2　两组造模后血浆ET-1、CGRP和IL-6水平比较（±s,pg/mL）

表2　两组造模后血浆ET-1、CGRP和IL-6水平比较（±s,pg/mL）

注：与对照组比较1）P＜0.05

组别　n　ET-1　CGRP　IL-6治疗组　8　35.32±11.471）　8.90±1.611）　42.34±10.871）对照组　8　64.49±27.91　6.23±1.26　64.78±15.84

2.3两组造模后神经功能评分比较

两组造模后1 d神经功能评分比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。治疗组造模后3 d、5 d神经功能评分与同组造模后1 d比较，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。治疗组造模后3 d、5 d神经功能评分与对照组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。详见表3。

表3　两组造模后神经功能评分比较　（±s,分）

表3　两组造模后神经功能评分比较　（±s,分）

注：与同组造模后1 d比较1）P＜0.05；与对照组比较2）P＜0.05

组别　n　造模后1 d　造模后3 d　造模后5 d治疗组　8　2.00±0.76　1.50±0.531）2）　1.38±0.521）2）对照组　8　2.50±0.96　2.13±0.83　2.00±0.54

3　讨论

脑血管痉挛是由多种因素引起脑局部血管痉挛、血管内径缩小、脑血管阻力增加、脑血流量减少而致脑部供血不足，引起相应神经功能障碍的脑血管病变。早在1951年，就有学者描述了CVS的血管造影表现，认为是一种局限的、阶段的或弥漫性的血管异常狭窄，严重的CVS可以导致脑梗死。脑血管急性痉挛期以颅内压增高、脑血流量降低和脑灌注压降低为特征，SAH后早期发生的脑血管收缩在动物模型上十分明显。CVS的临床症状是头晕、头痛或脑梗死，还可能伴有恶心、呕吐、耳鸣、心慌、气短等症状，属中医学“中风”“头痛”“眩晕”等范畴。临床上针灸或针灸配合药物能够有效治疗缺血性脑血管病［8-10］，经高频超声检查颈动脉发现针灸后颈动脉粥样硬化程度减轻，血管自主调节功能有所恢复，血流速度增加，颈动脉远端阻力下降，血管弹性有一定程度的改善［11］。有研究［12］发现，针刺百会、风池穴能使TCD和CTP各项指标变化曲线的波峰压低或者波谷抬高，有效缓解CVS的高峰，显著改善临床预后，对动脉瘤性蛛网膜下腔出血后血管痉挛有较好的治疗作用；针刺星状神经节可改善后循环缺血及降血压作用，可能与恢复迷走神经平衡、解除血管痉挛、保护血管内皮、逆转或延迟动脉粥样硬化的进程等有关。有研究［13-14］表明，在缺血缺氧的急性条件下，针刺内关穴可抑制ET的升高，减少一氧化氮下降，改善二者的失衡状态，从而缓解冠脉血管的痉挛状态，使心肌的吻合支血管更多地开放，而利于侧支循环的建立。我们在本实验中采用3D-CTA对实验性血管痉挛造模前后家兔的基底动脉直径进行动态检测，发现治疗组的血管痉挛程度明显低于对照组，证实电针预处理能有效预防CVS。

目前认为，导致SAH后发生CVS的主要途径有①微血管舒张-收缩平衡失调机制；②免疫炎症机制［15］。ET-1在神经系统有广泛分布，是由血管内皮产生的一种21个氨基酸组成的血管活性多肽，在血管内外均产生强烈而持久的缩血管作用，它是迄今为止已知最强大的内源性血管收缩物质。ET能够通过神经细胞内兴奋性氨基酸的释放和Ca2+内流等途径，导致CVS。CGRP是由37个氨基酸残基组成的生物活性肽，具有强烈的舒张血管作用。CGRP是迄今所知最强的内源性血管舒张物质，其作用不依赖于内皮细胞的完整性，去除内皮细胞后，舒张作用仍然存在。正常生理状态下血浆ET、CGRP水平保持相对平衡，共同维持脑血管的舒缩功能以调节脑血流变化，当两种血管作用的物质平衡破坏时，便导致血管舒缩功能失调。本实验中，在治疗前的测定发现CGRP与ET-1均在正常的范围之内，但电针处理后发现治疗组ET-1较对照组低，CGRP较对照组高，提示治疗组能通过对ET-1与CGRP的水平的调整，起到防治DCVS的作用。笔者前期的临床研究［16］也发现了这一现象。

自上世纪90年代开始，学者们就对CVS患者脑脊液和血清中IL-6水平进行研究，发现IL-6含量显著升高，且升高时间与CVS的发生一致，认为其参与CVS的病理过程。有实验研究［17］报道，CVS患者脑脊液在体外实验中引起了白细胞在血管壁的黏附聚集，将其注入鼠蛛网膜下腔后引起了CVS的发生，SAH患者脑脊液中中性粒细胞百分比上升及中性粒细胞酶活性增强［18］；显然IL-1、IL-6、TNF-α等免疫炎性因子参与了CVS的病理生理过程［19］。细胞因子IL-6是一种作用强烈的致炎因子，可诱发的黏附分子表达上调及介导白细胞与内皮细胞的相互作用，是炎症反应的关键因素［20-23］。本次研究中，发现经过针灸预处理的治疗组造模后血清IL-6水平较对照组低，血管痉挛程度较对照组轻，提示电针预处理组可能通过抗炎和免疫抑制起到解痉目的。

从神经功能障碍的改变来看，两组神经功能障碍不严重，可能同造模的方法有关。治疗组造模后1 d与造模后3 d、5 d组内比较，神经功能评分明显降低（均P＜0.05）；对照组造模后神经功能评分虽有降低，但无统计学意义，提示治疗组的神经障碍恢复快于对照组，电针预介入能加快脑血管痉挛家兔神经障碍的恢复。

根据临床经验与文献的查阅，本实验选取了足三里、内关和风池3个穴位，风池为足少阳胆经经穴，具有疏利清窍、平肝潜阳的作用［24-27］；内关为手厥阴心包经经穴，具有宽胸顺气、宁心安神的功效［28-30］；足三里为足阳明胃经经穴，能补气补血、填充脑髓。3穴配伍能够较好地作用于脑血管收缩和舒张功能失衡这一重要环节，达到防治迟发性脑血管痉挛的目的。

综上所述，电针预处理能够通过对ET-1与CGRP、IL-6水平的调整，参与抗炎和免疫抑制，起到防治迟发性脑血管痉挛的目的。

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【中图分类号】R2-03

【文献标志码】A

DOI：10.13460/j.issn.1005-0957.2016.05.0596

文章编号：1005-0957（2016）05-0596-04

收稿日期2016-01-14

Effect of Pre-intervention with Electroacupuncture on Cerebral Vasospasm in Rabbit Models

CHEN Pin-jie，WANG Zhen-zhang，LIN Chao-wei，CHEN Yong，FENG Xiao-zhen，CHEN Chong，XIE Wen-xia.
The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou 325000，China

［Abstract］ObjectiveTo observe the effect of electroacupuncture in preventing delayed cerebral vasospasm（DCVS）.Method Sixteen healthy Japanese big ear rabbits were randomized into a treatment group and a control group，8 in each group.The treatment group was developed into models by intramuscular anesthesia on the 6th day after 5 days'20-min daily intervention of transcutaneous acupoint electrical stimulation during a specific time period；the control group was developed into models by the same way on the 6th day but without electrical stimulation.The diameter of basilar artery was measured by using CTA prior to the electrical stimulation and after modeling in both groups，the plasma levels of ET-1，CGRP，and IL-6 were detected，and behavioral changes 1 d，3 d，and 5 d after modeling were observed.ResultAfter modeling，there was a significant difference in comparing the basilar artery diameter between the two groups（P＜0.05）.The plasma levels of ET-1，CGRP，and IL-6 in the treatment group were significantly different from that in the control group（P＜0.05）.In the treatment group，the neural function scores 3 d and 5 d after modeling were markedly different from that 1 d after modeling（P＜0.05）.There were significant differences in comparing the neural function scores 3 d and 5 d after modeling between the two groups（P＜0.05）.ConclusionPre-intervention with electroacupuncture prevents and improves DCVS possibly via modulating the levels of ET-1，CGRP，and IL-6，and subsequently involving in anti-inflammation，immune inhibition，and vasodilation.

［Key words］Electroacupuncture；Vasospasm，Intracranial；Basilar artery；Rabbits