针刺内关穴对心肌肥厚小鼠心肌组织超微结构的影响

张淼，王文君，祝鹏宇，郭颖，李书霖（.黑龙江中医药大学附属第二医院，哈尔滨 5000；.黑龙江中医药大学，哈尔滨 50040；.黑龙江省中医药管理局，哈尔滨 50090）



·动物实验·

针刺内关穴对心肌肥厚小鼠心肌组织超微结构的影响

张淼1，王文君2，祝鹏宇1，郭颖1，李书霖3
（1.黑龙江中医药大学附属第二医院，哈尔滨 150001；2.黑龙江中医药大学，哈尔滨 150040；3.黑龙江省中医药管理局，哈尔滨 150090）

【摘要】目的观察针刺内关穴对小鼠心肌肥厚状态的影响。方法将36只健康C57BL6小鼠随机分为空白组、模型组和治疗组，每组12只。治疗组针刺内关穴，每日1次，每次留针15 min。治疗9 d后，比较各组心脏重量/胫骨长度值的变化。对各组小鼠左心室心肌组织行Masson三原染色法，采用普通光学显微镜在100倍视野下观察各组心肌纤维排列及胶原纤维分布的差异。并用透射电子显微镜观察受损心肌组织肌节结构，肌原纤维排列，胶原纤维及线粒体等超微结构。结果与空白组比较，模型组心率显著增快，治疗组心率显著降低。模型组和治疗组心脏重量、心脏重量/胫骨长度比值均较空白组显著增加（P ＜0.01）；治疗组心脏重量、心脏重量/胫骨长度比值均较模型组显著降低（P＜0.01）。模型组心肌组织出现代偿性肥大且呈现不连续状态，少数心肌横纹出现严重紊乱/断裂，核固缩及胞浆嗜酸性变明显；治疗组优于模型组。模型组部分肌原纤维灶性融合，间质胶原纤维增生，线粒体肿胀及代偿性增多，治疗组优于模型组。结论针刺内关穴能够减少胶原纤维及线粒体等的产生，整合肌节结构排列，延缓心肌肥厚的进展。

【关键词】针刺疗法；穴，内关；心肌肥厚；超微结构；小鼠

慢性心力衰竭（CHF）是由于各种增加心脏负荷的因素诱发心室重构，导致心脏泵血功能障碍而引起的病理疾患［1］，机理复杂且持续进展加重。心功能因各种诱因受损早期，心肌收缩力逐渐减弱，为保证心脏正常的血液输出，机体补充建立以心肌肥厚为主的代偿机制［2］。代偿以心肌纤维增生为主，伴随线粒体增大和变多，为克服心脏压力负荷，需维持相当的心排血量直至失代偿。

近年来炎症和心肌肥厚的关系受到研究者们的广泛关注，微炎症作为一种低强度、慢性进展的非显性炎症状态，贯穿了心肌代偿的整个过程，是心肌肥厚进展加重进入失代偿阶段的重要因素［3］。炎性状态对心肌影响除部分炎症因子增多外，主要见于心肌间质水肿，炎细胞浸润及肌纤维变性、坏死，后期显示炎细胞浸润减少消失，间质有明显灶性病理改变。针灸特定穴已被众多实验证明对于调节改善炎性状态有较好的作用［4］，而针刺对于心肌肥厚的影响作为针灸抗炎理论的一种具体探索方向值得研究。本实验观察针刺内关穴对心肌肥厚小鼠心肌组织超微结构的影响，现报告如下。

1　材料和方法

1.1实验动物

C57BL6小鼠36只，雄性，6～8周，体重为20～25 g，清洁级［SCXK（吉）-2013-0005］，动物喂养于黑龙江中医药大学针灸实验室，小鼠适应性喂养1星期后实验。

盐酸异丙肾上腺素注射液（ISO），Masson染色试剂盒购自珠海贝索生物技术有限公司。

1.3实验分组

36只小鼠随机分为正常组、模型组和治疗组，每组12只。治疗组针刺内关穴（参照《实验动物针灸穴位图谱》结合人体穴位定位），留针15 min，期间每5 min轻微捻转针1次，30 min后腹腔注射 ISO（15 mg/kg）。每日1次，共治疗9 d。正常组注射等量生理盐水，持续9 d。模型组每日注射ISO（15 mg/kg），持续9 d［5］。

1.4观察指标

治疗完成后描记小鼠心电，电子天平称重，3%水合氯醛（0.1 mL/10 g）麻醉后断颈，参照小鼠立体定位图谱取材，记录心脏重量，游标卡尺准确测量胫骨长度（后肢内踝下缘至胫骨平台），计算心脏质量/胫骨长度。切下左心室心肌组织按试剂盒步骤说明行MASSON染色［6］。在普通光学显微镜下观察，倍数选取100倍来观察各组镜下结构的差异。左心室区仔细切取1 mm× 3 mm×1 mm心肌组织3～4块，制作超薄切片置FEI/ Philips TCNAI G2型透射电子显微镜下观察、拍片，每个标本拍片3～5张（放大11500倍）。

1.5统计学方法

用SPSS19.0软件进行统计分析，实验数据以均数±标准差表示，各组数据经过正态性检验和方差的齐性检验后便可进行统计分析，组间比较用单因素方差分析（one-way ANOVA检验）和t检验。以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2　结果

2.1小鼠心率（HR）的变化

如表3所示，PP注塑件气味在第20天的时候强度降低，之后稳定在2.5级，主要是由于残存在PP注塑件表面的小分子物质随着时间延长逐步挥发，之后与空气中的小分子达成平衡，在没有高温的作用下，趋于稳定状态。如图2所示，随着时间的延长，甲醛、乙醛含量逐步降低，在15～20 d的时候，残留在PP注塑件表面的醛类物质随空气流通挥发，然后是热氧化降解的醛类物质随着时间的延长慢慢释放，直至检测不到。所以，在标准实验室条件下，PP注塑件放置20 d，气味、VOC可以达到一个较好的状态。

由图1可见，各组小鼠心率差别明显，相较于空白组，模型组心率增快，治疗组心率降低。

图1　各组小鼠心率

2.2各组小鼠心脏质量、胫骨长度比较

由表1可见，模型组和治疗组小鼠心脏重量及心脏重量/胫骨长度比值与空白组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。模型组小鼠心脏重量及心脏重量/胫骨长度比值与模型组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。提示动物模型的建立是比较成功的，针刺内关穴可以使小鼠心脏重量及心脏重量/胫骨长度比值降低，其数值较模型组有显著性差异，证明治疗方法是有效的。

表1　各组小鼠心脏质量、胫骨长度比较　（±s）

表1　各组小鼠心脏质量、胫骨长度比较　（±s）

注：与空白组比较1）P＜0.01；与模型组比较2）P＜0.01

组别　n　心脏重量（mg）　胫骨长度（mm）　心脏重量/胫骨长度（mg/mm）空白组　12　119.17±9.96　17.23±1.38　6.93±0.48模型组　12　146.67±14.971）　16.42±0.77　8.93±0.781）治疗组　12　138.72±18.441）2）　17.87±2.23　7.76±0.611）2）

2.3各组光镜下MASSON染色心肌纤维化比较

为区别于HE染色，镜下组织间质充斥的胶原纤维被染为蓝色。空白组显示心肌纤维排列整齐，形态完整，胞浆丰富，胞核饱满。细胞边界清晰，细胞核位于肌纤维中央，心肌间质和心肌未见异常。心肌细胞的纵切面横纹清晰，细胞核居中，少量血管及结缔组织分布。横切面为不规则的多角形，核周围可见点状放射状排列的肌原纤维。相比于空白组，模型组心肌组织出现代偿性肥大且呈现不连续状态，心肌细胞炎性浸润明显，间质密布蓝色胶原纤维，少数心肌横纹出现严重紊乱/断裂，核固缩及胞浆嗜酸性变明显。治疗组与模型组比较，心肌细胞间质蓝色胶原纤维减少，细胞紊乱明显减轻。详见图2。

2.4各组电镜下心肌细胞超微结构比较

空白组基本结构清晰，肌原纤维排列规则，可见成排线粒体分布于肌原纤维间，内外膜完整，嵴清晰。模型组线粒体内外膜不清晰，部分线粒体嵴絮状变性，肌节明暗带部分融合消失，部分肌原纤维灶性融合，间质胶原纤维增生，线粒体发生肿胀及代偿性增多。治疗组肌节结构尚可，肌原纤维未见损伤，少量线粒体肿胀，浆细胞不明显。详见图3。

图2　各组光镜下MASSON染色心肌组织结构（×100）

图3　各组电镜下心肌细胞超微结构（×11500）

3　讨论

心肌肥厚属于中医学“胸痹”“心痛”范畴，《普济方·针灸》：“穴内关主心中愦愦。”《圣济总录》：“内关，系于心包络，心系实则心痛，虚则为烦。”《玉龙经》：“阴维为病苦心痛。”《二十八难》：“阴维，起于诸阴交也，维络诸阴脉会于任脉。”诸经行于胸腹胁肋，其循行主治与《医宗金鉴》相印证，即内关穴主治气块上攻心胸，胁肋疼痛。

在脊神经节的外周部位，心脏及心神经的内脏传入纤维与内关区的传入神经纤维有2～3个节段的重叠，而以Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ为主的脊髓各板层又交汇于中枢部位［7-8］，理论上针刺内关穴处的神经纤维可引起心脏区的神经调节，对心肌细胞的异常状态产生一定的调节作用。连接内关的纤维可以经由迷走神经节和脊神经节的神经元传导信号到达连接心脏的神经纤维，而迷走神经可能作为一个重要环节参与针刺对肥大心肌产生的一系列影响。

ISO作用于心脏β1受体，使心收缩力增强，传导加速。小鼠注射异丙肾上腺素后，心输出量和心肌耗氧量增加，心率增快，表现为模型组小鼠心率明显高于空白组。针刺通过抑制前额叶内侧区对自主神经系统起调节作用，可增加副交感神经活性，降低交感神经活性，且副交感神经的活性与针刺得气的程度呈正相关［9］。因此，治疗组小鼠心率相比模型组呈明显下降趋势。

机体因生长产生的体重波动，使得用体重作为衡量正常心脏重量的参考值具有不可靠性。比较体重作为标准，以往的研究数据显示更同意通过胫骨长度估算心脏重量，这使我们能够排除纵向生长的因素干扰［10］。心肌代偿性肥大导致心脏重量呈现上升趋势，同时实验因素对于各组间小鼠胫骨长度影响有限，使得结果中模型状态小鼠系数值显著高于正常状态。

心肌组织镜下以炎性浸润及纤维化为主要表现，组织中Ⅰ/Ⅲ型胶原比例增加、过量沉积且分布杂乱，是由冠状动脉粥样硬化性狭窄状态引起的心肌缺血缺氧所导致［11］，伴邻近心肌纤维增粗或萎缩，可能源于后负荷增加导致冠脉动脉内皮产生缺陷，易受内部血液流动冲击的影响，破坏胶原分泌的平衡［12］。在冠脉周围，AngⅡ的活性及其表达均高于其他部位［13］，可以激活心肌成纤维细胞合成大量的胶原纤维。心肌缺血缺氧等因素引起的心脏异常重构过程中，组织细胞的损伤可导致机体的免疫-炎症反应，相关分子物质受到刺激激活释放到细胞间质或血液中，镜下可表现出明显炎性浸润。

超微结构下，心肌组织肌节结构的紊乱是心脏功能出现异常的直接原因。心肌肥厚代偿过程中肌节结构发生明显异常，肌节明暗带随之消失，内外膜结构发生异常，通常伴随线粒体数量和体积的变化。线粒体一方面通过ATP合成参与能量供应，一方面也进一步对细胞凋亡形成调控机制［14］。利用ISO诱导心肌肥厚模型的损伤机制相当复杂，打乱线粒体能量代谢、神经体液调节紊乱和诱导细胞进一步凋亡等导致心肌细胞病理改变［15］。心力衰竭发生时将导致氧气和能量供应下降［16-19］，机体产生反馈性病理刺激，导致出现离子水平异常和线粒体肿胀明显，内膜和嵴断裂或缺损，嵴排列不规则。

本实验结果显示，治疗组小鼠治疗后心率及心脏重量/胫骨长度比值较模型组显著降低，光镜镜下胶原纤维分布较模型组减少，炎性浸润改善；超微结构显示肌节排列结构明显优于模型组，内外膜基本完整，仅部分线粒体肿胀。研究从形态学证实了针刺内关穴能够改善异丙肾上腺素造成的心肌细胞损伤，改善细胞内外的炎性状态，对心脏有一定的保护作用。而针刺过程中涉及的具体神经体液调节方式尚待进一步研究。

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【中图分类号】R2-03

【文献标志码】A

DOI：10.13460/j.issn.1005-0957.2016.05.0588

文章编号：1005-0957（2016）05-0588-04

收稿日期2016-01-22

基金项目：黑龙江省自然科学基金项目（H201315）；哈尔滨市应用技术研究与开发项目（2013RFQYJ076）

作者简介：张淼（1973-），女，教授，硕士生导师

通信作者：李书霖（1973-），男，博士生

Effect of Acupuncture at Point Neiguan on Myocardial Ultramicrostructure in Myocardial Hypertrophy Mice

ZHANG Miao1，WANG Wen-jun2，ZHU Peng-yu1，GUO Ying1，LI Shu-lin3.
1.Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine Second Hospital，Harbin 150001，China；2.Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine，Harbin 150040，China；3.Heilongjiang Province Administration of Traditional Chinese Medicine

［Abstract］ObjectiveTo investigate the effect of acupuncture at point Neiguan on mouse myocardial hypertrophy.Methods Thirty-sixty healthy C57BL6 mice were randomized into blank，model and treatment groups，12 rats each.In the treatment group，an acupuncture needle was inserted into point Neiguan and retained for 15 min，once daily.After nine days of treatment，the ratios of cardiac weight/tibial length were compared between the groups.Left ventricular myocardial tissues were processed by Masson trichrome staining in every group of mice.The differences in myocardial fiber arrangement and collagen fiber distribution between the groups were observed under the ordinary optical microscope in 100 times of field of vision.Sarcomere structure，myofibril arrangement，collagen fibers and mitochondria in injured myocardial tissues were observed by transmission electron microscopy. ResultsHeart rate increased significantly in the model group and decreased significantly in the acupuncture group compared with the blank group.Cardiac weight and the ratios of cardiac weight/tibial length increased significantly in the model and acupuncture groups compared with the blank group（P＜0.01）and decreased significantly in the acupuncture group compared with the model group（P＜0.01）.In the model group，myocardial tissues had compensatory hypertrophy with incontinuous status，and myocardial transverse striations had severe disorder/disruption，karyopyknosis appeared and cytoplasmic eosinophilic change became obvious in few of the rats.The results were better in the acupuncture group than in the model group.In the model group，part of myofibrils had focal fusion，interstitial collagen fibers proliferated and mitochondria had swelling and compensatory increase.The results were also better in the acupuncture group than in the model group.ConclusionsAcupuncture at point Neiguan can reduce the production of collagen fibers and mitochondria，improve the arrangement of sarcomere structure and delay the progression of myocardial hypertrophy.

［Key words］Acupuncture therapy；Point，Neiguan；Myocardial hypertrophy；Ultramicrostructure；Rats