改进硝基四氮唑蓝比色法用于黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选

高晓慧，唐晶晶，刘浩然，刘英姿

（1.湖南中医药大学药学院，长沙410208；2.湖南大学化学化工学院，长沙　410082；湖南师范大学医学院，长沙　410006）

改进硝基四氮唑蓝比色法用于黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选

高晓慧1，唐晶晶2，刘浩然2，刘英姿3*

（1.湖南中医药大学药学院，长沙410208；2.湖南大学化学化工学院，长沙410082；湖南师范大学医学院，长沙410006）

【摘要】目的：建立简单方便的测定黄嘌呤氧化酶的方法。方法：在现有方法的基础上，采用十二烷基硫酸钠（SDS）为终止剂，改进硝基四氮唑蓝法测定了黄嘌呤氧化酶的方法。SDS浓度为10%。酶反应时间为25min。结果：与原方法相比，改进的方法具有不产生蓝色沉淀、不必离心就可直接测定，准确度、精密度好的优点。适合于测定在紫外区有吸收的化合物对黄嘌呤氧化酶的作用。结论：以SDS为终止剂的硝基四氮唑蓝法简单易行，适合于黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选。

【关键词】黄嘌呤氧化酶；硝基四氮唑蓝；十二烷基硫酸钠；抑制剂

黄嘌呤氧化酶是广泛分布于人体心、肺、肝等组织细胞浆内的一种酶。其主要功能为催化黄嘌呤和次黄嘌呤转变为尿酸。尿酸在人体内的升高将引起高尿酸血症、痛风等症状。因此，抑制黄嘌呤氧化酶可以减少尿酸的生成，从而缓解上述疾病。目有已在临床应用的黄嘌呤氧化酶抑制剂有别嘌醇、非布司他［1，2］。文献中报道的测定黄嘌呤氧化酶的方法，以紫外分光光度法和硝基四氮唑蓝比色法较其它方法简单、方便［3，4］。紫外分光光度法是以黄嘌呤或次黄嘌呤氧化后产生的尿酸在295nm处有最大吸收来测定的。因很多化合物本身在295nm处有较大吸收，不适于筛选化合物对黄嘌呤氧化酶的作用。硝基四氮唑蓝法的缺点则是其显色产物甲臜不溶于水、干扰测定。为此，我们在前人的基础上改进了硝基四氮唑蓝比色法，其快速、简便，适合于黄嘌呤氧化酶抑制剂的初步筛选工作。

1　材料与方法

1.1主要试剂黄嘌呤，纯度＞98%，上海源叶生物科技有限公司，Lot：AJ0722MA14；氯化硝基四氮唑蓝（NBT），纯度＞98%，上海源叶生物科技有限公司，Lot：T23J6C1；黄嘌呤氧化酶，BR，50U/mg蛋白，上海源叶生物技术有限公司，Lot：A0818C2；十二烷基硫酸钠（SDS）、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、盐酸、氨水、曲拉通X-100（TritonX-100）均为分析纯。超纯水，自制。

1.2主要仪器UV1902型紫外可见分光光度计，上海奥析仪器有限公司；HHA型恒温水浴锅，浙江金坛仪器有限公司。高速冷冻离心机，湖南湘仪有限公司；Eppendorf移液枪；玻璃匀浆器。

2　方法与结果

2.1试剂配制PBS（100mmol/L，pH=7.4）：以磷酸二氢钠、磷酸氢二钠按适当比例配制成pH7.4的缓冲液。黄嘌呤（15mmol/L）：适量氨水溶解黄嘌呤，再加PBS配制成溶液，临用前配制。NBT（2.5mmol/L）：以PBS配制成缓冲液，4℃下避保存。SDS（10%）：精密称取SDS适量，加水配制成10%的溶液。黄嘌呤氧化酶，以PBS稀释，备用。

2.2XOD测定步骤根据多次摸索，考虑到1cm光径的比色皿容积在2.5～3.0ml之间较为合适，选择酶反应体系总体积为2.9ml。测定步骤如下表所示。

表1　XOD测定操作表

涡旋混匀。37℃孵育25min于534nm处在紫外可见分光光度计上测定吸光度。

记标准管吸光度为A标，酶空白管吸光度为A酶空，底物空白管吸光度为A底空，化合物测量管吸光度为A化，化合物空白管吸光度为A化空。

化合物对XOD的抑制率（%）=（A标-A化）/（A标-A酶空-A底空-A化空）*100%

如果化合物对XOD有抑制作用，先通过初测获知其抑制率在0%-80%的浓度区间，再配制此区间不同浓度的化合物进行测定，可求出半抑制浓度（IC50），从而获知化合物对XOD的抑制强度。

2.3结果

2.3.1三种不同终止剂对比色法测定XOD的影响我们将改进后的实验方法与之前方法所测定的结果进行了对比。文献中报道的终止反应剂有盐酸和三氯醋酸［5，6］。盐酸主要是使反应液处于酸性环境，迅速终止反应。但缺点是反应产物甲臜不溶于水，易产生沉淀。三氯醋酸既有终止反应的作用，又有沉淀蛋白的作用。酶促反应液最后要进行离心才可测定。耗时较多。SDS是测定酶活性的通用型终止剂。其原理是使蛋白质可逆变性。因酶本质为蛋白质，SDS使之变性，酶活性即消失，从而停止催化底物反应。由于SDS本身是一种表面活性剂，亲水亲油平衡值较大，亦是常用的增溶剂。在此反应中，SDS既终止了酶促反应，又能增溶酶解产物甲臜。

2.3.2SDS所需浓度考察

为考察SDS作为终止剂的合适的浓度，我们以不同浓度的SDS加入反应体系中。平行配置相同的样本，分别考察加入后的吸光度、加入后继续孵育5min、10min后的吸光度。

表2　不同终止剂硝基四氮唑蓝比色法的优缺点比较

表3　不同浓度SDS终止XOD酶促反应的比较

上述结果表明，SDS浓度低于2%将不能完全抑制XOD活性，5%SDS基本抑制XOD活性，10%SDS可完全抑制XOD活性。因此，采用10%的SDS作终止剂。

2.3.3显色稳定性分别测定三份样品在SDS终止反应后避光条件下的稳定性。结果如表4所示。

表4　NBT显色稳定性考察

3　讨论

目前对于药物或食品中XOD活性或抑制活性的测定方法有色谱法、电化学法、紫外分光光度法及NBT比色法等［7-10］。其中，紫外分光光度法根据黄嘌呤或次黄嘌呤氧化后的产物尿酸在295nm处有最大吸收来测定，有较多文献采用此法。此法适合于测定临床样本，但在测定黄嘌呤氧化酶抑制剂时不太合适。许多被测试的化合物在295nm处有较强的吸收，对实验的干扰较大。NBT比色法的原理是黄嘌呤或次黄嘌呤被黄嘌呤氧化酶氧化的过程中产生超氧阴离子，后者与NBT反应生成有色化合物甲臜。文献报道的NBT法常以三氯醋酸或盐酸来终止反应、离心，取上清再测定吸光度。我们研究发现，其产物甲臜在水中及缓冲液中溶解度很小，量过大时会形成沉淀，在离心过程中被蛋白吸附，造成结果不准确。如果用盐酸终止反应，若生成过量的甲臜，将会在缓冲液中形成极微细的不溶颗粒，在分光光度计上测定时会形成散射，从而造成结果不准确。曾有实验采用在缓冲液中加入TritonX-100等增溶剂的方法来测定［11］，但我们实践中发现，Triton X-100可抑制XOD，造成假阳性干扰，因此没有采用。

通过反复实验比较，我们采用SDS为终止剂。SDS终止酶促反应的机理是使蛋白质（酶）可逆变性，失去活性。同时，SDS又是一种优良的表面活性剂，其亲水亲油平衡值较大，是良好的增溶剂。因此，SDS既可终止反应，又对生成的甲臜有一定的增溶作用，使之不会形成沉淀，不必离心即可直接测定。其最大吸收在530nm左右，在530-560nm之间吸收峰较平坦，可根据实际情况适当调整检测波长以达到最大的灵敏度。NBT反应后的产物甲臜在4h内完全稳定，经历12h后吸光度略有下降。本法测定黄嘌呤氧化酶的活性，操作简单、快速方便，可广泛用于黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选。

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【中图分类号】R446.1

【文献标识码】A

【文章编号】1673-016X（2016）03-0142-03

收稿日期：2016-01-10

通讯作者：刘英姿，Email:liuyingzi111@sina.com

Improved nitroblue tetrazolium colorimetric method applied to the screening of xanthine
oxidase inhibitors

Gao Xiao-hui1, Tang Jing-jing2, Liu Hao-ran2, Liu Ying-zi3*
（1. College of pharmacy, Hu’nan University of Chinese Medicine, Changsha 410208； 2. College of chemistry and chemical engineering, Hu’nan University, Changsha 410082； Medical College, Hu’nan Normal University, Changsha 410006）

［Abstract］Objective To establish a simple and convenient method for determination of xanthine oxidase（XOD）. Methods On the basis of previous research, an improved method applied with nitroblue tetrazolium was used for the determination of the xanthine oxidase with 10% sodium dodecyl sulfate （SDS） as terminating agent. The reaction time for the enzyme was 25min. Results The activity of XOD can be determined with improved method which can directly determined without centrifugation since no blue precipitation produced, it is more accuracy and precise compared with the original method. This method is suitable for the investigation on the effect of compounds with ultraviolet absorption on XOD. Conclusion The modified method with SDS as terminator is simple and suitable for the screening of xanthine oxidase inhibitors.

［Keywords］Xanthine oxidase； Nitroblue tetrazolium； Sodium dodecyl sulfate； Inhibitor