远端缺血预处理对缺血再灌注后肾功能的保护

董文培，李　涛，于　平，李　权，张铁龙，梁军号

(1.上海交通大学医学院附属新华医院泌尿外科，上海　200092;2.上海交通大学医学院，上海　200025)



·基础研究·

董文培1,2，李涛1,2，于平2，李权1,2，张铁龙1,2，梁军号1,2

(1.上海交通大学医学院附属新华医院泌尿外科，上海200092;2.上海交通大学医学院，上海200025)

摘要：目的观察在动物模型中远端缺血预处理(RIPC)对缺血再灌注后肾功能是否有保护作用。方法将雄性SD大鼠24只随机分成4组各6只：空白组，缺血再灌注组，早期RIPC组，晚期RIPC组。空白组仅分离左右肾蒂及肾周组织，45 min后关腹；缺血灌注组于大鼠右下肢置松弛止血带30 min后分离左右肾蒂和肾周组织，切除右肾并夹闭左肾蒂45 min后复灌；早RIPC组和晚RIPC组先行30 min RIPC后，两者分别于即刻和24 h后采取同缺血灌注组措施。术后24 h检测血肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)，取左肾组织行HE染色病理分析和检测髓过氧化物酶(MPO)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)。结果缺血灌注组、早RIPC组和晚RIPC组术后24 h的Cr、BUN、MPO、MDA、SOD和病理评分各项指标均显著升高(P<0.05)。与缺血灌注组相比，早RIPC组和晚RIPC组有显著保护效果，且晚RIPC组保护效果较早RIPC组好(P<0.05)。结论RIPC可为缺血再灌注后肾功能提供保护，且晚期保护窗作用较明显，其机制可能与降低氧化应激反应、抑制炎性细胞浸润有关。

关键词：远端缺血预处理；缺血再灌注；肾功能

在泌尿外科手术中，如肾部分切除术、肾移植手术等，肾脏会面临一段缺血过程，而后血流复灌将导致缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury, IRI)。不少保护措施，如缩短缺血时间、术中采取低温措施等可降低缺血再灌注对器官的损伤。1986年缺血预处理(ischemic preconditioning, IPC)的现象在动物心脏缺血再灌注中被发现[1]。MURRY等[1]证实对左回旋支冠状动脉进行缺血预处理后，可减少其后缺血对心肌的损伤。在1993年，PRZYKLENK等[2]发现远端缺血预处理现象(remote ischemic preconditioning,RIPC)，即通过对冠状动脉回旋支的预处理，可降低左前降支冠脉梗阻引起的心肌梗死损伤范围。此后，更多研究发现对心外器官或组织，如肾脏[3]、小肠[4]、肢端[5]的缺血预处理也能实现对心脏的保护作用，并且不同时期保护作用不同[6]。但是目前，RIPC对肾功能的保护作用仍具有争议性[7-9]。为此，本研究的目的在于动物模型中探寻RIPC对肾功能是否有保护作用，并比较不同时期RIPC作用的差异性。

1材料与方法

1.1实验动物与手术方法本实验采用雄性斯泼累格·多雷(Sprague Dawley, SD)大鼠(210±20)g，予以标准饮食喂养，术前12 h禁食，不禁饮。本实验动物随机分成4组:空白组、缺血再灌注组、早期RIPC组、晚期RIPC组，每组6只。以4 mg/kg戊巴比妥钠麻醉后，空白组开腹，分离左右肾蒂及肾周组织，45 min后关腹；缺血灌注组于右下肢股骨上1/3置松弛止血带30 min，后开腹分离左右肾蒂和肾周组织，在切除右肾并以微创血管夹夹闭左肾蒂45 min后，松开血管夹复灌，关腹；早期RIPC 组先在右下肢股骨上1/3以止血带夹闭5 min和松开5 min，连续3个循环共计30 min的RIPC后，其余措施同缺血灌注组[5]；晚期RIPC组采取同早RIPC组预处理后，24 h后，再采取同缺血灌注组措施。所有动物在术后24 h处死。

1.2标本采集与检测所有动物在分离右肾蒂时，采集右肾动脉血样检测术前Cr、BUN。在处死前，采集左肾动脉血样检测术后24 h的Cr、BUN，同时取下左肾组织，一分为二，一份置于4%多聚甲醛中留后HE染色行病理分析；一份冻存用于检测MPO、MDA和SOD。上述指标采用相应试剂盒检测(南京建成科技有限公司)。

1.3HE染色及病理诊断将保存于4%多聚甲醛的肾组织制成5 μm厚度切片后进行HE染色。病理切片评分标准采用PALLER[10]和YURDAKUL[11]的肾小管损伤评分法。

2结果

2.1急性肾损伤造模评判在24 h后，与空白组相比，缺血灌注组的Cr，BUN显著增高(P<0.01)。在肾组织氧化应激损伤指标MPO、MDA、SOD上，缺血灌注组均高于空白组，有显著意义(P<0.01)，表明急性肾损伤模型造模成功(表1)。

2.2肾损伤指标经过RIPC预处理后，早期RIPC组和晚期RIPC组的Cr、BUN、MPO、MDA水平低于缺血灌注组(P<0.05)。在Cr、MPO、MDA指标上，早期RIPC组和晚期RIPC组相比，无明显统计学差异(P>0.05)；但在BUN指标上，早期RIPC组显著高于晚期RIPC组(P<0.05)；在SOD指标上，早期RIPC组和晚期RIPC组高于缺血灌注组，晚期RIPC组较早期RIPC组高(P<0.05，见表1)。

表1肾功能损伤指标

△：与空白组比较，P<0.05；#：与缺血灌注组比较，P<0.05；*：与早期RIPC组比较，P<0.05。

2.3肾HE病理评分早期RIPC组和晚期RIPC组病理得分显著低于缺血灌注组(P<0.001)，且晚期RIPC组得分低于早期RIPC组(P<0.05，图1)。在肾小管HE病理切片上，在空白组看见部分小管细胞肿胀，刷状缘缺失和细胞凋亡；在缺血灌注组，除上述病理改变外，可见管腔多灶性坏死、管腔碎片以及管腔扁平扩张和管型；早期RIPC和晚期RIPC组亦可见灶性坏死、管腔扁平扩张和管型，但损伤程度较缺血灌注组小(图2)。

图1术后24 h肾小管HE病理评分比较

*：晚期RIPC与早期RIPC组相比，P<0.05；#：空白组、早期RIPC组分别与缺血灌注组相比，P<0.001。

图2术后24 h肾小管病理镜下观(HE，×400)

A：空白组；B：缺血灌注组；C：早期RIPC组；D：晚期RIPC组。

↑：细胞肿胀，刷状缘消失和细胞凋亡；☆：灶性坏死；△：小管扁平扩张或管型。

3讨论

机体在正常生理情况下氧自由基的形成量极少，寿命短，加上机体自由基的清除系统，两者在体内维持动态平衡。在平衡体系中，超氧化物歧化酶SOD作为氧自由基清除剂的代表，一定程度上代表了氧自由基清除活力的指标；丙二醛MDA作为生物膜脂质降解的主要代谢产物，常作为反映脂质过氧化反应程度的指标[12-14]。髓过氧化物酶MPO是中性粒细胞和巨噬细胞的功能和激活标志，反映组织炎性细胞浸润程度[15]。

器官血液供应中断将会导致缺血再灌注损伤，在缺血状态下，缺氧组织间发生氧化应激反应，产生大量的高活性自由基，破坏自由基产生和清除的平衡系统，加剧生物膜的氧化损伤，引起并促进炎性细胞浸润，进一步加剧细胞和组织损伤。

RIPC最早由PRZYKLENK等[2]在动物模型中发现具有缩小心梗面积的保护作用，在心外科领域运用于临床。RIPC对肾功能的保护作用具有争议性[7-9]，对既往回顾性分析发现其在动物模型中保护作用较明显，在临床试验中因患者选择，RIPC方案、手术方式等因素造成不同研究间保护差异较大。本研究建立在大鼠急性肾缺血再灌注模型后，发现经RIPC预处理后的早期RIPC、晚期RIPC组的损伤程度较低。通过对实验观察指标分析，RIPC预处理可能通过某种机制在一定程度上降低了氧自由基生成和MDA水平，同时增加SOD活力，提升组织中自由基清除能力；此外显著降低髓过氧化物酶MPO水平，降低炎性细胞浸润，改善肾功能Cr、BUN指标，提供明显的保护作用。

RIPC保护作用分为两个时期：早期保护窗(acute phase)和晚期保护窗(delayed phase)[9，16]。早期保护窗在RIPC预处理后即可起效，作用时间约4 h；晚期保护窗在预处理后约12 h发挥作用，持续时间可达72 h[17]。在本研究中发现晚期RIPC可提升SOD活力和改善BUN，降低肾小管损伤，较早期RIPC有明显优势。可能机制是晚期RIPC激活并通过体液循环等作用影响了肾组织的基因转录和表达，为肾脏提供更多的保护作用，这在非肾器官心肺等脏器的研究中得到证实[18]。

总之，RIPC预处理可能通过某种机制抑制氧自由基生成的同时，促进超氧化物歧化酶活力升高，降低了生物膜氧化应激反应，改善了炎性细胞浸润，为缺血再灌注后肾功能提供保护作用，晚期RIPC的保护作用明显。RIPC的保护机制和运用有待进一步深入研究。

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(编辑何宏灵)

收稿日期：2015-09-23修回日期：2016-01-25

基金项目:上海市科委基金资助(No.14ZR1426900)

通讯作者:梁军号，副主任医师，硕士生导师.E-mail：ljh24103@gmail.com

作者简介:董文培(1990-)，男(汉族)，硕士在读.研究方向：泌尿系肿瘤的微创治疗.E-mail：zjdwp-wz@163.com

中图分类号:R691

文献标志码:A

DOI：10.3969/j.issn.1009-8291.2016.05.015

The protective effect of remote ischemic preconditioning on renal function after ischemia reperfusion injury

DONG Wen-pei1,2, LI Tao1,2, YU Ping1, LI Quan1,2, ZHANG Tie-long1,2, LIANG Jun-hao1,2

(1.Department of Urology, Xinhua Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200092;2.School of Medicine, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200025,China)

ABSTRACT:ObjectiveTo investigate whether remote ischemic preconditioning (RIPC) provides renal protection after ischemia reperfusion injury in animal model. Methods A total of 24 rats were equally divided into four groups: sham group, ischemia reperfusion group (IR group), acute RIPC group, and delayed RIPC group. Sham group received a sham operation; IR group had a right nephrectomy immediately following a 45 min ischemia by applying microvascular on left kidney; acute RIPC group accepted RIPC before surgery; delayed RIPC group received RIPC 24 h earlier. Cr, BUN, MPO, MDA, SOD and tubular score were measured 24 h after ischemia reperfusion. ResultsThe levels of Cr, BUN, MPO, MDA, SOD and tubular score were significantly increased in IR, acute RIPC and delayed RIPC groups. Compared with IR group, acute RIPC group and delayed RIPC group had better renal protection, and the delayed group achieved more (P<0.05). ConclusionRIPC can offer protection for kidney suffering IRI and the effect of delayed RIPC is more obvious, for RIPC may suppress the oxidative stress reaction and inhibit inflammatory cell infiltration.

KEY WORDS:remote ischemic preconditioning; ischemia reperfusion; renal function