复方黑面神软膏处方提取工艺研究

萧俊祺　　彭伟文　　董旺凤　　李圣鹏（广州中医药大学附属中山市中医院，广东 中山 528400）

复方黑面神软膏处方提取工艺研究

萧俊祺彭伟文董旺凤李圣鹏
（广州中医药大学附属中山市中医院，广东 中山 528400）

目的：建立复方黑面神软膏中表儿茶素和苦参碱含量的测定方法，优化提取工艺条件。方法：采用高效液相色谱法（HPLC）测定表儿茶素和苦参碱含量，并运用正交试验考察浸泡时间、加水量、提取时间和提取次数对苦参含量的影响。结果：表儿茶素在0.008 4～ 0.033 6 g/L内线性关系良好，回归方程：y=13 346x+ 11.632，r=1.000 0。最佳水提工艺：药材加20倍量水浸泡45 min，80℃温浸提取2次，每次1 h。苦参碱在0.029 4～ 0.588 g/L线性关系良好，回归方程：y=1 714.9x-3.835 5，r=0.999 9，平均回收率达96.7%，RSD为 1.18%。煎煮最佳工艺条件：药材加20倍水浸泡45 min，提取两次，每次1 h。结论：HPLC测定复方黑面神软膏中表儿茶素和苦参碱的含量操作简便，专属性强，准确可靠，可用于复方黑面神软膏的质量控制。

复方黑面神软膏；苦参碱；正交试验；高效液相色谱法

黑面神为大戟科植物黑面神（Breynia fruticosa （L.）Hook.f.）的干燥全株，具有清湿热、化瘀滞的功效，用于湿疹、皮肤瘙痒、过敏性皮炎、漆过敏、阴道炎、外阴瘙痒、带状疱疹等多种疾病的治疗［1］。彭伟文等［2］在黑面神的药理作用上作了研究，验证了其有抗炎作用、免疫抑制作用、抗皮肤Ⅰ型超敏反应作用。针对黑面神在上述疾病方面的独特疗效，拟研制出以黑面神为主药，苦参为臣药，蛇床子、白鲜皮和地肤子为佐药的外用制剂复方黑面神软膏。

王英晶等［3］通过高效液相色谱法（HPLC）对黑面神枝叶中表儿茶素含量进行了测定。本实验在此基础上运用HPLC测定复方黑面神软膏君药黑面神中表儿茶素和臣药苦参中苦参碱的含量，并运用L9（34）正交试验优化其提取工艺，为 HPLC测定黑面神复方制剂的含量奠定基础。

1　仪器和试药

1.1仪器

高效液相色谱仪（美国Agilent 1100 series）；BS224S型电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；KQ3200E型医用超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；HH-S4数显恒温水浴锅（金坛市医疗仪器厂）；RE-2000B型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；SHB-Ⅲ型循环水真空泵（巩义市英峪华中仪器厂）；东方-A型直热式电热恒温干燥箱（广州东方电热干燥设备厂）。

1.2试药

黑面神（广州至信药业有限公司），经广州中医药大学生药鉴定教研室鉴定为大戟科黑面神属植物（Breynia fruticosa（L.）Hook.f.）；苦参（广州至信药业有限公司，批号：140601）；蛇床子（广州至信药业有限公司，批号：150101）；地肤子（亳州市毫广中药饮片有限公司，批号：20120722）；白鲜皮（广州至信药业有限公司，批号：140601）；表儿茶素对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110878-200102）；苦参碱对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110805-200508）。水为屈臣氏蒸馏水；甲醇为色谱纯；其他试剂为分析纯。

2　方法与结果

2.1指标成分含量测定

2.1.1色谱条件色谱柱为Boston Green ODS C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为甲醇-0.1%磷酸溶液，采用梯度洗脱，其程序见表1。流速1.0 mL/min，柱温30℃，检测波长分别为：表儿茶素 280 nm，苦参碱220 nm，进样量为20 μL。理论塔板数按表儿茶素计算不低于3 600，按苦参碱计算不低于4 000。根据以上条件，表儿茶素和苦参碱的保留时间分别为48.333 min和10.026 min。色谱图见图1～ 4。

图1　　表儿茶素对照品溶液HPLC图

图2　　表儿茶素供试品溶液HPLC图

图3　　苦参碱对照品溶液HPLC图

图4　　苦参碱供试品溶液HPLC图

2.1.2对照品溶液的制备精密称取表儿茶素对照品8.4 mg，加50%甲醇制成每1 mL含0.84 mg的溶液，摇匀，得表儿茶素对照品溶液；精密称取苦参碱对照品 14.7 mg，加甲醇制成每 1 mL含1.47 mg的溶液，摇匀，得苦参碱对照品溶液。

2.1.3供试品溶液的制备取黑面神药材30 g加20倍量水浸泡45 min，80℃温浸提取2次，每次1 h，过滤得药渣，滤液70℃减压浓缩到一定量，用50%甲醇定容至50 mL，得表儿茶素供试品溶液。药渣和剩余的4味药（苦参15 g，白鲜皮10 g，蛇床子8 g，地肤子5 g）加20倍量水浸泡45 min，提取2次，每次1 h，提取液过滤，浓缩至一定浓度，加95%乙醇沉淀至70%浓度，4℃放置一夜，抽滤，滤液回收乙醇，用甲醇定容至50 mL，得苦参碱供试品溶液。

2.1.4标准曲线的制备分别精密吸取“2.1.2”中表儿茶素和苦参碱对照品溶液0.1，0.2，0.5，1.0，2.0，4.0 mL置5 mL量瓶中，表儿茶素用50%甲醇稀释至刻度，苦参碱用甲醇稀释至刻度，在“2.1.1”条件下进样20 μL。以进样浓度（g/L）为横坐标（x），以峰面积为纵坐标（y）绘制标准曲线，表儿茶素回归方程为：

y=13 346x+11.632（r=1.000 0），

线性范围：0.008 4～ 0.033 6 g/L。苦参碱回归方程为：

y=1 714.9x-3.835 5（r=0.999 9），

线性范围：0.029 4～ 0.588 0 g/L。

2.1.5精密度试验分别精密吸取同一浓度的表儿茶素对照品溶液和苦参碱对照品溶液，在“2.1.1”条件下连续进样6次，测得表儿茶素含量和苦参碱含量，结果显示表儿茶素含量RSD=1.85%，苦参碱含量RSD=1.17%。

2.1.6重复性试验取6份30 g黑面神，按表儿茶素供试品溶液的制备方法进行处理。另取黑面神药渣，苦参15 g，白鲜皮10 g，蛇床子8 g，地肤子5 g，共6份，按苦参碱供试品溶液的制备方法进行处理，在“2.1.1”条件下进样分析，分别测得表儿茶素含量和苦参碱含量，结果显示表儿茶素含量RSD=0.95%，苦参碱含量RSD=1.39%。

2.1.7稳定性试验取黑面神按表儿茶素供试品溶液的制备方法进行处理，另取黑面神药渣，苦参，白鲜皮，蛇床子和地肤子，按苦参碱供试品溶液的制备方法进行处理，分别于0，2，4，8，16，24 h在“2.1.1”条件下进样分析，分别测得表儿茶素含量和苦参碱含量，结果显示表儿茶素含量RSD= 1.43%，苦参碱含量 RSD=0.96%，表明样品在24 h内稳定。

2.1.8回收率试验分别按表儿茶素供试品溶液和苦参碱供试品溶液的制备方法进行处理后的样品平均各分为6份，平行分2组，分别精密加入表儿茶素对照品0.350 mg和0.715 mg，苦参碱对照品0.350 mg和0.715 mg，按各自供试品溶液的制备方法进行处理，在“2.1.1”条件下进样分析，结果显示表儿茶素平均回收率达98.2%，RSD=0.75%。苦参碱平均回收率达97.5%，RSD=0.67%，表明表儿茶素和苦参碱加样回收率试验良好，符合定量分析要求。结果见表2～ 3。

表2　　表儿茶素加样回收率试验结果

表3　　苦参碱加样回收率试验结果

2.2正交试验

2.2.1表儿茶素提取正交试验

2.2.1.1水提工艺条件为优选出黑面神的最佳提取工艺，以表儿茶素为考察指标，设计L9（34）正交试验对浸泡时间，加水量，提取时间和提取次数进行考察（表4）。

表4　　表二茶素正交试验因素和水平

2.2.1.2表儿茶素正交样品溶液的制备取黑面神 30 g置1 000 mL烧杯中，按L9（34）正交试验表进行提取，具体工艺流程如下：黑面神→加水浸泡→80℃浸泡→过滤→水提液→减压浓缩→定容至50 mL→得9份样品溶液。在“2.1.1”条件下进样分析，测定表儿茶素含量，结果见表5～ 6。

2.2.1.3试验结果分析从直观分析结果可知，影响表儿茶素含量高低的各考察因素次序为D＞A＞C＞B，方差分析结果显示，浸泡时间、加水量和提取时间对表儿茶素含量的影响无显著性差异（P＞0.05），提取次数对表儿茶素含量的影响有显著性差异（P=0.031＜0.05）。综合考虑各影响因素，最终确定优选的提取工艺条件为A2B1C2D2，即 30 g黑面神加 20倍量水浸泡 45 min，80℃温浸提取2次，每次1 h。

表5　　正交试验结果

表6　　表儿茶素方差分析结果

2.2.2苦参碱提取正交试验

2.2.2.1水提工艺条件为优选出苦参的最佳提取工艺，以苦参碱的含量和干膏率为考察指标，设计 L9（34）正交试验进行考察，其程序见表7。

表7　　苦参碱正交试验因素和水平

2.2.2.2苦参碱正交样品溶液的制备取黑面神药渣、15 g苦参、10 g白鲜皮、8 g蛇床子和 5 g地肤子置1 000 mL烧杯中，按L9（34）正交试验表进行提取，具体工艺流程如下：

原处方药材→加水浸泡→煎煮→过滤→水提液→浓缩至一定体积→醇沉→静置一夜→抽滤→滤液回收乙醇→浓缩→定容至50 mL→得9份样品溶液。在“2.1.1”条件下进样分析，测定苦参碱含量，结果见表8～ 9。

2.2.2.3干膏得率的测定参照《中国药典》2010年版一部（附录ⅩA）浸出物测定法［4］，将正交试验所得的药液浓缩至10 mL，分别置于已干燥至恒重的蒸发皿（设质量为W1）中，水浴挥干，残渣于105℃干燥 3 h，取出，置干燥器中冷却30 min，迅速精密称定质量（设质量为W2），通过以下公式计算干膏得率：

结果见表8和表10。

表8　　正交试验结果

表10　　苦参碱含量方差分析结果

2.2.2.4试验结果分析从直观分析结果可知，各考察因素对干膏得率的影响次序为B＞D＞C＞A（表10），对苦参碱含量的影响次序为C＞B＞D＞A（表9），综合评分影响提取效率的因素次序为D＞B＞C＞A（表8和表11）。由方差分析结果可知，加水量和提取次数对苦参碱含量的影响有显著性差异（P=0.041＜ 0.05，P=0.036＜0.05），浸泡时间和提取时间对苦参碱含量的影响无显著性差异（P＞0.05）。通过综合考虑，确定优选提取工艺条件为A2B3C2D2，即黑面神药渣、苦参、白鲜皮、蛇床子和地肤子加20倍量水浸泡45 min，煎煮提取2次，每次1 h。

表9　　干膏得率方差分析结果

表11　　综合评分方差分析结果

3　小结与讨论

表儿茶素有一定的热不稳定性，根据前期实验研究，从黑面神中提取表儿茶素时采用80℃温浸提取法提取得到的表儿茶素含量最高，在本次实验的预实验中也得到了验证。预实验还比较了温浸提取法，醇提水沉法和水提醇沉法对苦参中苦参碱含量的影响。结果显示，水提醇沉法苦参碱得率较温浸法高。故选择温浸提取为表儿茶素的提取方法，水提醇沉法提取作为苦参碱的提取方法。为体现本实验研究复方剂型的性质，每次提取苦参碱时加入温浸提取后的黑面神药渣。因用甲醇定容制得的表儿茶素供试品所测得的峰面积过小，而用50%甲醇定容制得的表儿茶素供试品测得的峰面积较大且分离度较好，故制备表儿茶素对照品溶液和供试品溶液时用50%甲醇定容。

《中国药典》2010年版记载测定苦参碱含量时，色谱柱填充剂为氨基键合硅胶，流动相为乙腈-无水乙醇-3%磷酸溶液（80∶10∶10），检测波长为220 nm。在此条件下进行预实验，发现苦参碱在2 min左右出峰，拖尾严重且峰形较差。究其原因可能是本次实验使用C18色谱柱而不是氨基键合硅胶色谱柱。此条件下表儿茶素没有明显峰形。在检测波长为280 nm，选用流动相甲醇-0.1%磷酸溶液进行梯度洗脱时，苦参碱出峰时间为10.02 min，分离度明显改善但仍有拖尾。表儿茶素出峰时间为48.333 min，峰形较好。当波长改为220 nm，在此梯度洗脱条件下，苦参碱峰形得到进一步改善，但表儿茶素峰形不如在280 nm波长下检测到的。故表儿茶素选用280 nm为检测波长，苦参碱选用220 nm为检测波长，流动相均为甲醇-0.1%磷酸溶液梯度洗脱。

近年来对黑面神药理作用及临床应用的研究报道日益增多，但在黑面神复方制剂研究方面进展缓慢，尤其是在国内。研究黑面神，既可为黑面神属植物化学成分的分类奠定基础，也可为进一步研究开发黑面神复方制剂奠定基础。本次实验结果为黑面神及其复方制剂的应用提供了一定的实验依据。

［1]《广东中药志》编辑委员会.广东中药志（第一卷）［M］.广州：广东科技出版社，1990：362.

［2］彭伟文，谭泳怡，梅全喜，等.黑面神水提物抗炎作用实验研究［J］.今日药学，2012，22（3）：145-147.

［3］王英晶，彭伟文，梅全喜，等.黑面神枝叶中表儿茶素的含量测定及水提工艺优化［J］.中国实验方剂学杂志，2014，20（9）：93-95.

［4］国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）［S］.北京：中国医药科技出版社，2010.

Procedure for Extraction of Compound Breynia Fruticosa Ointment

Xiao Junqi，Peng Weiwen，Dong Wangfeng，Li Shengpeng（Zhongshan Traditional Chinese Medical Hospital Affiliated to Guangzhou Univeristy of Traditional Chinese Medicine，Guangdong Zhongshan 528400，China）

Objective：To develop a method for determination of epicatechin and matrine contents in compound breynia fruticosa ointment and optimize theprocedure for extraction.Methods：The epicatechin and matrine contents were determined by high performance liquid chromatography（HPLC）.The effects of time for immersing，ratio of solid to liquid as well as time duration for extraction and number of extraction cycle on the matrine content were evaluated by orthogonal test.Results：The linear range of epicatechin was 0.008 4～ 0.033 6 g/L，of which the regression equation of standard curve was as fbllows：y=13 346x+11.632，r=1.000 0.The optimal water extraction procedure was as fb1lows：the materials were immersed with water at 20 times of the volume for 45 min，and extracted at 80℃ for 2 times，1 h for each.The linear range of atrine was 0.029 4～ 0.588 g/L，while the regression equation was as follows：y=1 714.9x-3.835 5，r=0.999 9.The mean recovery ofmatrine was 96.7%，with a RSD of 1.18%.The optimal condition for decoction extraction was as fo1lows：the materials were immersed with water at 20 times of the volume for 45 min and extracted for 2 times，1 h for each. Conclusion：HPLC method for determination of matrine is simple，specific，accurate and reliable，which may be used for quality control of compound breynia fruticosa ointnent.

Compound Breynia Fruticosa Ointnent；Matrine；Orthogonal Test；High Performance Liquid Chromatography（HPLC）

10.3969/j.issn.1672-5433.2016.01.004

广东省中山市科技局项目（20102A033）

萧俊祺，男，药师。主要从事中药制剂开发与研究。E-mail：602045059@qq.com
彭伟文，男，主任中药师，教授，硕士生导师。主要从事中药制剂开发与研究。通讯作者E-mail：pww200688@21cn.com

2015-08-12）