HPLC法测定硫酸氢氯吡格雷有关物质

吴相永

摘 要：建立高效液相色谱法测定硫酸氢氯吡格雷有关物质的方法。根据文献资料[4，5]，采用高效液相色谱法，以手性色谱柱，建立了硫酸氢氯吡格雷的有关物质测定方法，方法简便，准确。采用ULTRONES-OVM（Analytical）手性柱（150mm×4.6mm，5μm），色谱填料为L57。以0.01mol/L磷酸二氢钾溶液-乙腈（75∶25）为流动相，检测波长为220nm。硫酸氢氯吡格雷和杂质B1之间的分离度大于2.5，符合要求。本方法具有简便、快捷、准确、灵敏和专属性强的特点，符合本品有关物质的测定要求。

关键词：高效液相色谱法；硫酸氢氯吡格雷；有关物质测定

1 引言

硫酸氢氯吡格雷（Clopidogrelhydrogensulfate）是一种血小板聚集抑制剂，临床上用于预防和治疗因血小板高聚集状态引起的心、脑及其他动脉的循环障碍疾病[1-3]。由法国Sanofi-Aventis原研，1998年美国上市，2001年在我国批准上市，商品名波立维（ Plavix）。根据文献资料[4，5]，采用高效液相色谱法，以手性色谱柱，建立了硫酸氢氯吡格雷的有关物质测定方法。

2 实验部分

2.1 仪器与试药

仪器 安捷伦1100高效液相色谱仪带二极管阵列检测器

ULTRONES-OVM手性色谱柱（ 15cm×4.6mm，5μm）

梅特勒-托利多MX205分析天平

试药 硫酸氢氯吡格雷对照品（ 中国药品生物制品检定所），批号：100819-200601

杂质A：USP对照品（批号：G0H250），用于杂质定量分析。

杂质B：USP对照品（批号：G1H047），用于杂质定量分析。

杂质C：USP对照品（批号：F2H215），用于杂质定量分析。

2.2 方法的建立

2.2.1检测波长的选择

将本品、杂质A、杂质B和杂质C制成适当溶液后进行紫外扫描，结果本品和已知杂质的紫外吸收行为类似，均在270nm、277nm和低波长附近处有最大吸收。由于多数物质在低波长处均有吸收，且本品与已知杂质的低波长区吸收强度远高于270nm，因此为更多的检出未知杂质，同时参考USP31版中硫酸氢氯吡格雷测定的检测波长220nm，选择低波长220nm作为有关物质的测定波长。

2.2.2色谱条件的确定

参考国家标准（WS1-（X-471）-2003Z）[4]和USP31版药典[5]的有关物质检测方法，并进行了对比研究，最终选择了本品的有关物质检测条件：采用ES-OVM柱；以0.01mol/L磷酸二氢钾溶液-乙腈（75：25）为流动相；检测波长：220nm；进样量：10μl；流速：1.0ml/min。

2.2.3系统适用性试验

按上述色谱条件进行试验，取杂质对照品溶液进样，记录色谱图，出峰顺序分别为杂质A、杂质B第一个异构体（杂质B1）、硫酸氢氯吡格雷、杂质B第二个异构体（杂质B2）和杂质C；取系统适用性试验用溶液进样，杂质B第一个异构体与硫酸氢氯吡格雷分离度不小于2.5，实际测得结果为3.3。

2.3 方法学验证与结果

2.3.1专属性试验

分别量取溶剂空白、未破坏样品、酸破坏、碱破坏、热破坏、光破坏溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。结果本品在酸、碱、热及强光照射条件下均有不同程度的破坏，新增大的降解峰主要为杂质A和杂质C，并且与硫酸氢氯吡格雷峰分离良好，可知本方法专属性高，适合对本品有关物质的检测。

2.3.2最低检测限、定量限

取硫酸氢氯吡格雷对照品、杂质A、杂质B和杂质C贮备液各适量，分别加流动相稀释至峰响应值约为基线噪音水平3倍、10倍的浓度，精密量取各供试液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，计算最低检测限和定量限。结果见表1。

2.3.3进样精密度试验

取杂质对照品溶液，连续进样6次，考察杂质A、杂质B1、硫酸氢氯吡格雷和杂质C的峰面积变化情况，结果杂质A、杂质B1、硫酸氢氯吡格雷和杂质C峰面积的RSD分别为3.0%、3.3%、1.8%、2.8%，RSD均小于10，说明本方法进样精密度良好，符合杂质定量测定的要求。

2.3.4重复性试验

取本品约100mg，精密称定，置200ml量瓶中，用甲醇5.0ml溶解后加流动相稀释成至刻度，摇匀，作为供试品溶液。分别配制6份供试品溶液，各精密量取10μl进样分析，以外标法计算已知杂质的量，考察测定结果的相对标准偏差，结果雜质A、杂质B1、杂质C峰面积的RSD分别为3.9%、5.4%、1.8%，均小于10%，说明本法重复性良好。

2.3.5线性试验

分别精密量取硫酸氢氯吡格雷对照品、杂质A、杂质B和杂质C贮备液适量，加流动相逐级稀释，得硫酸氢氯吡格雷、杂质A、杂质B1和杂质C的线性试验溶液。精密量取各溶液10?l分别进样，记录色谱图。

以峰面积A为纵坐标、浓度c为横坐标做线性回归，得杂质A、杂质C、硫酸氢氯吡格雷、杂质B1的曲线分别为：A = 21.365c -1.4165，r=0.9981，A = 15.156c-0.2251，r=0.9979，A = 17.724c + 3.8769，r=0.9995，A = 19.711c -0.1161，r=0.9995。试验结果表明杂质A在浓度0.41～4.88μg/ml，杂质B1在浓度0.6～11.46μg/ml，杂质C在浓度3.43～12.21μg/ml，硫酸氢氯吡格雷在浓度0.36～3.98μg/ml范围内，浓度与峰面积呈良好的线性关系。

2.3.6回收率试验

采用加样回收的方法对杂质A、B和C进行了回收率试验研究。

杂质A对照品母液的配制：取杂质A适量，用甲醇溶解并稀释至每1ml含杂质A约40μg的溶液，即得。

杂质B对照品母液的配制：取杂质B适量，用甲醇溶解并稀释至每1ml含杂质B约120μg的溶液，即得。

杂质C对照品母液的配制：取杂质C适量，用甲醇溶解并稀释至每1ml含杂质C约200μg的溶液，即得。

供试品溶液的配制：取本品约100mg，置200ml量瓶中，加甲醇5.0ml溶解后加流动相稀释至刻度，摇匀，作为样品贮备母液；取5ml，置10ml量瓶中，分别加杂质A对照品母液、杂质B对照品母液和杂质C对照品母液各0.8ml、1.0ml和1.2ml，得含有80%、100%和120%杂质的供试品溶液，每份各平行配制三次。

精密量取上述供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，以外标法计算加入杂质的含量，计算回收率及相对标准偏差，结果杂质A、杂质B1、杂质C回收率分别为106.7%、106.1%、101.6%，RSD分别为4.4%、5.8%、2.7%。由上述试验结果可知，杂质A、杂质B1和杂质C的回收率良好，均在80%～120%之间，且RSD%均小于10，满足已知杂质定量测定的要求

2.3.7耐用性试验

在确定的有关物质测定方法的基础上，分别考察了流动相比例变化±5%、柱温变化±5℃和流速變化±0.2 ml/min对有关物质测定结果的影响。试验结果表面，当温度、流速和流动相比例发生略微改变时，有关物质的测定结果基本不受影响。

2.3.8有关物质测定的溶液稳定性

取本品约100mg置200ml量瓶中，加甲醇5.0ml溶解后加流动相稀释成至刻度，摇匀，室温下放置，分别于0、2、4、8小时进样测定，记录色谱图。结果表明本品的有关物质溶液在8小时内基本稳定，满足分析测定的需要。

3 讨论

3.1 本文采用手性色谱柱，能使主成分及各杂质有效分离，结果准确可靠，满足测定要求；

3.2本法测定硫酸氢氯吡格雷有关物质， 专属性强， 结果准确、 灵敏、 快速。为硫酸氢氯吡格雷的质量控制提供了值得借鉴的方法。

参考文献

[1]袁静.氯毗格雷的药理学、临床疗效和耐受性[J].中国临床药学杂志，1999，8（4）：69—70.

[2]Mitakos A，PandenL.A Validated LC Method for theDetermination of Clopidogrel in Pharmaceutical Preparations[J].J.Pharm Biomed Anal.， 2002， 28（3）： 431—438.

[3]孙立平，张林潮.氯吡格雷在冠心病中的应用[J].医学综述， 2006， 12（19）： 1190— 1192.

[4]国家药典委员会.新药转正标准硫酸氢氯吡格雷[S].WS1-（X-471）-2003Z，北京：化学工业出版社，2003.

[5]美国药典委员会.美国药典[M/CD].第32版，美国：美国光盘发行社，2008.