基于HPLC-MS检测食品中新霉素和潮霉素B的残留量

□戴 辉 孟 晶 祖立青 乐丽欢

（上海科茂粮油食品质量检测有限公司 上海 普陀区 200333）

基于HPLC-MS检测食品中新霉素和潮霉素B的残留量

□戴 辉 孟 晶 祖立青 乐丽欢

（上海科茂粮油食品质量检测有限公司 上海 普陀区 200333）

目的建立测定食品中新霉素和潮霉素B氨基糖苷类药物残留量的液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)。方法样品中的氨基糖苷类药物经磷酸盐缓冲液提取后，经过弱阳离子固相萃取柱富集净化后，采用液相色谱-三重四极杆串联质谱检测，使用电喷雾离子化源(ESI)，在正离子条件下以多反应监测(MRM)方式进行扫描。结果线性范围为10～1 000μg·kg-1，新霉素和潮霉素B的最低定量浓度(LOQ)为100μg/kg，最低检测浓度(LOD)为30μg/kg。；以加标样品计算，在各浓度水平下，各被测物的方法回收率为60%～120%。结论本方法准确、高效，适用于食品中氨基糖苷类药物残留量的检测。

氨基糖苷；液相色谱-串联质谱；残留检测

氨基糖苷类化合物(aminoglycosides)作为广谱抗生素的一种，其抗菌活性是针对诸多革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。氨基糖苷酸抗生素在兽医界和畜牧业中,被广泛用于治疗细菌性感染。但任何事物都具有两面性，氨基糖苷类抗生素具有不可逆的耳毒性和肾毒性等不良反应，为了保证广大消费者安全健康的饮食,美国食品及药物管理局 (Food and Drug Administration)和欧盟委员会针对肉类,奶类及奶制品、蛋类等动物源性食品进行了几种氨基糖类化合物最大残留限量（Maximum residuelimit）的设定。

氨基糖苷类是由两个或多个氨基糖通过苷键与氨基环醇键合而成的一类化合物，其结构由于缺少发色团和荧光团，需要在柱前或柱后衍生化反应结束后，采用液相色谱-荧光或紫外检测。因为氨基糖苷类具有较强的极性，不易挥发，在进行衍生化反应后，也会需要继续使用气相色谱法测定。这些衍生化的方法不仅操作比较繁琐，而且稳定性较差。本次试验采用内标法，对动物源性食品中的新霉素和潮霉素B，这2种氨基糖苷类药物残留量进行检测，经过较为严格的方法学验证，对于测定动物源食品中氨基糖苷类药物的残留量内定法具有准确且高效的特点。

1 材料与方法

1.1 仪器与药品

LC-MS 8050型三重四极杆串联质谱仪 (日本岛津公司)，配有电喷雾离子化源(ESI源)；LC-30A超高效液相色谱仪(日本岛津公司)；MS 3 basic旋涡混合器 (德国 IKA)；D-37520台式冷冻离心机 (美国Thermo公司)。Oasis混合型弱阳离子(WCX)固相萃取柱(3cm3，60mg，30μm，美国 Waters公司)。

新霉素和潮霉素B对照品购买于美国 Sigma公司；乙腈、甲醇、醋酸、醋酸铵、甲酸均为色谱纯；磷酸氢二钠为分析纯；试验用水为超纯水。

1.2 方法

1.2.1 试样制备。肌肉组织及器脏组织、水产品类取适量新鲜或冷藏的样品，绞碎，并均质。置-18℃以下冰箱中冷冻保存。另准备空白样品，绞碎后置于-18℃以下冰箱中冷冻保存，作为空白样品备用。

1.2.2 提取和净化。前处理1：取5.00g样品，加入7.5%EDTA缓冲盐溶液0.5ml（视情况而定，可不加），加入5%三氯乙酸溶液10ml，涡旋1min，超声20min，4000r/min离心5min，取上清液于一离心管，残渣中加入10ml5%三氯乙酸溶液重复提取一次，合并上清液。取10ml上清液，用氨水准确调ph=7，（用高速离心机离心后）准备上WCX小柱。WCX小柱依次用2ml甲醇、2ml水活化。上样，待样液自然流完，依次用2ml水，2ml甲醇淋洗，弃去淋洗液，用2ml5%甲酸甲醇洗脱。洗脱液过有机滤膜后直接上仪器待测。

前处理2：取5.00g样品，加入7.5%EDTA缓冲盐溶液0.5ml（视情况而定，可不加），加入5%三氯乙酸溶液10ml，涡旋1min，超声20min，4000r/min离心5min，取上清液于一离心管，残渣中加入10ml5%三氯乙酸溶液重复提取一次，合并上清液，取10ml提取液(PH≤1)，准备上HLB小柱。HLB小柱依次用2ml甲醇、2ml水活化。上样，待样液自然流完，用5ml水淋洗，2ml甲醇洗脱。洗脱液过滤膜上仪器待测。

前处理3：取5.00g样品，加入7.5%EDTA缓冲盐溶液0.5ml（视情况而定，可不加），加入5%三氯乙酸溶液10ml，涡旋1min，超声20min，4000r/min离心5min，取上清液于一离心管，残渣中加入10ml5%三氯乙酸溶液重复提取一次，合并上清液，取10ml提取液，准备上MCX小柱。MCX小柱依次用5ml甲醇、5ml水活化。上样，待样液自然流完，依次用5ml水，5ml乙腈，5ml乙腈甲酸铵水溶液（乙腈：2M甲酸铵水溶液=3:7）淋洗，再用5ml乙腈甲酸铵水溶液（乙腈：2M甲酸铵水溶液=3:7）（PH=8.0）洗脱，洗脱液过滤膜上仪器待测。

前处理1可测：壮观霉素、二氢链霉素、潮霉素B、链霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素

前处理2可测：安普霉素、妥布霉素、庆大霉素

前处理3可测：新霉素

1.2.3 标准曲线的制备。精密量取10μg/mL10种氨基糖苷类药物混合标准工作液适量，用样品空白基质配制成氨基糖苷类药物 浓度为 20、50、100、200、500ng/mL系列标准溶液，供液相色谱-串联质谱测定。以特征离子质量色谱峰面积为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。求回归方程和相关系数。

1.2.4 测定。

（1）色谱条件

a.除新霉素外九种氨基糖苷类

色谱柱：CORTECS Hilic 2.1*100mm 1.6μm；

流动相：A：250mM甲酸铵水（200mL中加800uL甲酸）B：200mM甲酸铵有机相（乙腈+甲醇+水=6+1+3）溶液，（200ml中加甲酸 400uL）；

流速：0.25mL/min；

柱温：30℃；

进样量：5μl；

表1 9种氨基糖苷类流动相梯度

b.新霉素的色谱条件

色谱柱：ZIC HILLIC 2.1*75mm 3μm；

流动相：A：250mM甲酸铵水（200mL中加800uL甲酸）B：200mM甲酸铵有机相（乙腈+甲醇+水=6+1+3）溶液，（200ml中加甲酸 400uL）；

流速：0.25mL/min；

柱温：30℃；

进样量：5μl；

表2 新霉素流动相梯度

（2）质谱条件

a）离子源：电喷雾离子源；

b）扫描方式：正离子扫描；

c）检测方式：多反应监测；

d）毛细管电压：Auto Tune(4.0KV)

e）Nebulizing Gas Flow:3L/min；

f）Heating Gas Flow:10L/min；

g）Interface Temperature:300℃；

h）DL Temperature:240℃；

i)Heat Block Temperature:400℃；

j)Drying Gas Flow:10L/min；

k）定量，定性离子对及碰撞能量见表2

表3 2种氨基糖苷类定量，定性离子对及碰撞能量

1.2.5 空白试验。除不加试料外，采用完全相同的步骤进行平行操作。

1.3 计算方法

1.3.1 定性判断。在相同实验条件下，样品中目标化合物与氨基糖苷类标准物质的保留时间一致，且监测离子对的相对丰度满足表3要求。可认为目标峰是氨基糖苷类物质。

表4 目标物离子对相对丰度比允许偏差范围

1.3.2 定量方法。将样品制备液与标准溶液等体积进样，建立标准工作曲线进行定量校准，标准溶液和样液中待分析物的响应均应在仪器测定的线性范围内。

计算公式：

X-样品中药物含量（μg/kg）；

C-仪器测定样液中药物含量（ng/mL）；

V-定容体积（mL）；

m-称取样品质量（g）；

计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示。

3 结果

3.1 检出限

最低定量浓度 (LOQ)与最低检测浓度(LOD)以信噪比 10∶1和 3∶1分别计算各被测物的LOQ和 LOD。新霉素和潮霉素B的最低定量浓度(LOQ)为 100μg/kg，最低检测浓度(LOD)为30μg/kg。

3.2 准确度

本方法在添加浓度水平为30～200μg/kg时新霉素和潮霉素B的回收率范围为60%～120%。

3.3 精密度

本方法的批内变异系数≤20%。

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1004-7026（2016）18-0097-03

S859.84

A

DOI：10.16675/j.cnki.cn14-1065/f.2016.18.075

戴辉（1985-），男，湖北黄冈人，本科，主要研究方向为食品检测分析。