荧光定量PCR技术在肺结核诊断中的应用研究

王　霖　王　辉　李才信　瞿春燕　马元肖

荧光定量PCR技术在肺结核诊断中的应用研究

王霖王辉李才信瞿春燕马元肖

【摘要】目的探讨荧光定量PCR技术在肺结核诊断中的应用价值。方法采用浓缩集菌涂片抗酸染色显微镜检查、美国BD960型分枝杆菌培养仪进行结核菌快速培养鉴定、荧光定量PCR结核分枝杆菌检测三种方法同时检测1000例肺结核患者的痰液标本，比较检测结果。结果PCR技术诊断阳性276例，阳性率27.6%（276/1000）；结核菌快速培养阳性252例，阳性率25.2%（252/1000）；涂片抗酸染色显微镜检查172例，阳性率17.2%（172/1000），结核抗酸菌涂片阳性率低于PCR技术及快速培养法（P＜0.05），且荧光定量PCR技术与结核菌诊断金标准快速培养阳性符合率为91.3%（252/276）。结论荧光定量PCR技术检测结核分枝杆菌DNA技术，对结核病进行诊断，与传统的涂片、培养相比较，可提高肺结核诊断的敏感性、特异性和及时性，以期使肺结核患者得到早期诊断及有效治疗。

【关键词】荧光定量；PCR技术；肺结核；诊断；应用

Objective To investigate the value of real-time PCR technique in the diagnosis of pulmonary tuberculosis.Methods Tuberculosis acid-fast smear examination，culture and identification of TB rapid，quantitative PCR three methods simultaneously detect 1000 cases of tuberculosis patients sputum samples，comparing the detected results.Results PCR diagnostic technique positive 276 cases，the positive rate of 27.6%（276/1000）.Rapid TB culture positive 252 cases，the positive rate of 25.2%（252/1000）.Tuberculosis acid-fast smear examination 172 cases，the positive rate of 17.2%（172/1000），acid-fast bacilli smear-positive tuberculosis rate was much lower than PCR technique and rapid culture（P＜0.05），and quantitative PCR and rapid TB diagnostic gold standard culture positive rate was 91.3%（252/276）.Conclusion The fluorescence quantitative PCR detection of tuberculosis DNA technology can improve TB diagnostic sensitivity，specificity and timeliness，so that TB patients receive early diagnosis and effective treatment.

【Key words】Fluorescence quantitative，PCR technology，Tuberculosis，Diagnosis，Application

结核分枝杆菌的实验室检测是结核病诊断和治疗转归确认的重要依据。提高实验室检测能力，促进早诊断、早治疗是有效控制结核病蔓延的必要措施。目前临床以集菌培养和涂片镜检法为主要的实验室检测手段［1］。大量研究表明传统方法的培养周期长、检出率低，难以满足临床需要。荧光定量PCR技术通过用一对结核分枝杆菌特异性引物和一条结核分枝杆菌特异性荧光探针，配以PCR反应液、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、四种核苷酸单体（dNTPs）等成分，用PCR体外扩增法检测结核分枝杆菌DNA，是一种重要的基因诊断技术，具有灵敏度高、特异性好、可定量、污染少，易于标准化、耗时短等优点［2］。本研究建立荧光定量PCR技术检测结核分枝杆菌的方法，并对荧光定量PCR技术在临床肺结核诊断和疗效评估中的应用进行评价，以期使肺结核患者得到早期诊断及有效治疗，为医院增加经济效益，让患者和公众受益，产生较好的社会效益和生态效益。

1　资料与方法

1.1样本来源

收集2015年9月～2016年3月昆明市传染病医院的1000例疑似肺结核患者，年龄18～60岁，男635例，女365例。采集所有患者痰标本进行实验检测。

1.2方法

1.2.1仪器美国伯乐BІO-RADCFX96实时荧光定量PCR检测仪，奥林巴斯显微镜，美国BDBACTECMGІT 960分枝杆菌/培养、鉴定、药敏快速自动检测系统。

1.2.2标本处理痰液中加入4倍体积的4%NaOH，摇匀，室温下放置30 min左右液化，取1 ml～1.5 ml离心管中，12000 rpm离心5 min。去上清，沉淀加无菌生理盐水1 ml打匀，12000 rpm离心5 min；再重复洗涤2次。沉淀直接加50μlDNA提取液充分混匀，提取液内含不溶于水的物质，取样时需用加样器充分混匀后吸取。如出现因吸头嘴部太细不能吸取或取样后堵塞吸头的现象，可用洁净无污染的剪刀将吸头嘴部剪去一截）。金属浴10 min（误差不超过1 min）。12000 rpm离心5 min。

1.2.3检测方法所有标本均采用浓缩集菌涂片抗酸染色显微镜检查、结核菌快速培养鉴定、荧光定量PCR结核分枝杆菌检测三种方法同时检测。

结核涂片抗酸检查：按照《痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》要求常规操作［3］。

结核菌快速培养鉴定：痰标本经4%NaOH消化处理后接种培养瓶放入美国BD960型分枝杆菌培养仪进行结核菌快速培养鉴定；噻吩-2-羧酸肼（PNB）生长试验进行分枝杆菌菌型鉴定，具体参照《结核病诊断实验室检验规程》常规操作［4］。

荧光定量PCR测定：取单管单人份PCR反应管若干，直接加入处理后样品或阴性物质2μl，8000 rpm离心数秒。将各反应管放入PCR仪，按下列条件扩增：93℃→2 min预变性，然后按93℃45 s→55℃120 s，共做30个循环后置33℃保温。PCR反应后荧光监测，待各PCR管充分冷却至33℃，迅速逐个将扩增后的反应管放入荧光检测仪，读取并记录读书A1。荧光激发波长为487 nm，检测波长为525 nm。

质量控制：阴性质控品：增长的曲线不呈S型或Ct值为空白。阳性质控品：增长曲线呈S型，且强阳性质控品定量参考值在1×106基因拷贝/ml～2×107基因拷贝/ml，临界阳性质控品定量参考值在2×102基因拷贝/ml～2×104基因拷贝/ml。

结果解释：阴性结果判定：如果定量值＜5.000E+02，则实验结果为阴性。阳性结果判定：如果定量值＞5.000E+02，则实验结果为阳性。

1.3统计学处理

本研究所有数据处理采用SPSS 19.0软件，计数资料以率表示，采用卡方校验，P＜0.05时差异具有统计学意义。

2　结果

2.1荧光定量PCR技术与结核菌快速培养检测结果比较

PCR技术诊断阳性276例，阳性率27.6%；结核菌快速培养阳性252例，阳性率25.2%，PCR技术诊断阳性率高于结核菌快速培养，数据差异具有统计学意义（χ2=5.675，P＜0.05），且PCR技术与快速培养阳性符合率为91.3%（252/276），见表1。

2.2荧光定量PCR技术与结核涂片抗酸检查结果比较

PCR技术诊断阳性276例，阳性率27.6%；结核涂片抗酸检查172例，阳性率17.2%。结核抗酸菌涂片阳性率低于PCR技术诊断阳性率，数据差异具有统计学意义（χ2=30.517，P＜0.05），且PCR技术与结核抗酸菌直接涂片法阳性符合率为62.3%（172/276），见表2。

表1　荧光定量PCR技术与结核菌快速培养检测结果

表2　荧光定量PCR技术与结核涂片抗酸检查结果

3　讨论

肺结核病原学检测是发现结核杆菌的重要途径。传统直接涂片抗酸染色显微镜检查虽然在操作性、及时性及经济性方面具有一定优势，但是敏感性较低，通常标本需达到100000条菌/ml的浓度才得到阳性结果，特异性差［5-7］。而培养法作为结核病诊断的“金标准”，具有较高的敏感度和特异性，但该方法具有周期长的缺点，常常需要4～8周才能出结果，且在结核与非结核分枝杆菌的辨别上，需要采用进一步鉴定［8-9］。

荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光基团，通过对荧光信号累积的监测，实现对PCR进程的监测，并能通过Ct值和标准缺陷对样品中的DNA或cDNA进行测定，1 d即可发放检验结果。该方法，在密闭状态下进行PCR扩增，有效保证了扩增物的无污染性，避免出现假阳性结果，检测的灵敏度与特异性也较高［10-12］。

本研究中收集1000例肺结核患者痰液标本，经过三种方法检测，结果显示，荧光定量PCR技术诊断阳性率27.6%，结核菌快速培养阳性率25.2%，结核涂片抗酸检查阳性率17.2%。结核抗酸菌涂片阳性率低于荧光定量PCR技术及快速培养法（P＜0.05）。荧光定量PCR技术与快速培养阳性符合率为91.3%，原因是结核患者用抗结核药物治疗后，结核菌受到抑制，无法培养出活的结核菌，但PCR技术可以检测出结核菌的基因片段，说明结核菌PCR技术诊断肺结核的特异性及敏感性均较高。此外，本实验室洁净度达到BSL-3生物安全实验室及环保相关要求，通过及早诊断、及早治疗，有效控制结核病，为营造和谐、健康的环境起到积极作用。

综上所述，利用荧光定量PCR技术检测结核分枝杆菌DNA，诊断肺结核由传统培养法的4～8周缩短至1 d即可发放检验结果，能使肺结核患者得到早期诊断及有效治疗，缩短患者诊断时间，降低患者治疗费用，对有效控制结核病起到积极的作用。

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【中图分类号】R440

【文献标识码】A

【文章编号】1674-9316（2016）11-0169-03

doi：10.3969/j.issn.1674-9316.2016.11.115

作者单位：昆明市传染病医院/昆明市第三人民医院检验科，云南昆明650301

Application of Fluorescence Quantitative PCR Technique in the Diagnosis of Pulmonary Tuberculosis

WANG Lin WANG Hui LI Caixin QU Chunyan MA Yuanxiao Department of Laboratory，Kunming Municipal Infectious Disease Hospital/ Kunming Third People's Hospital，Kunming Yunnan 650301，China

【Abstract】