海马网络theta振荡参与电针调整异常心血管活动的研究

董献文,徐颖(上海中医药大学,上海 201203)



海马网络theta振荡参与电针调整异常心血管活动的研究

董献文,徐颖
(上海中医药大学,上海 201203)

【摘要】目的观察海马网络电活动在电针调整异常心血管活动中变化,以此探讨电针调整心血管活动的中枢机制。方法实验大鼠随机分3组,乌拉坦正常麻醉组(n=15),乌拉坦加强深麻醉组(n=9),正常麻醉肛管加压组(n=15)。3组均记录股动脉血压、心电和海马场电、细胞放电,正常麻醉组没有干预措施,后两组在成功诱发异常血压后采取电针干预。结果乌拉坦正常麻醉大鼠出现睡眠样周期性海马电活动交替、伴周期性心血管活动,theta振荡对应心率加快;深麻醉低血压状态大鼠电针后海马网络出现theta振荡,伴血压升高,心率加快(P＜0.001);肛管加压诱发血压升高心率加快、海马网络theta振荡出现,此期电针仍能激活theta相关细胞,且降低血压、减慢心率(P＜0.001)。结论海马网络theta振荡参与了电针对异常心血管活动的双向调整作用。

【关键词】神经网络;theta振荡;电针;海马;血压;大鼠

针刺作为中医优势疗法具有作用广、毒副反应小、经济简便等优点,其早已被证明具有调整脑功能、抗应激、改善自主神经的功能,针刺也被用来治疗心血管活动异常性疾病。

由于时代的局限,中医学中没有血压的概念,也没有直接对血压异常疾病的记载,但对由血压异常导致的疾病如眩晕、头痛、虚劳等有详细的描述。《素问·至真要大论》:“诸风掉眩,皆属于肝。”《灵枢·海论》:“髓海不足,则脑转耳鸣。”中医学认为血压异常性疾病主要病机为阴阳失调,气血运行逆乱,肝阳上亢、肝肾阴虚颇为多见,此处肝阳、髓海、肾阴等与现代医学中自主神经尤其是交感神经系统以及脑功能、内分泌关系密切。原发性血压异常疾病尤其是原发性高血压多显示是神经源性,可见中医学早已认识到血压的神经调节异常是所谓的眩晕、头痛、虚劳等的主要致病原因。而针刺可以疏通经络,通调气血,调整阴阳,通过多途径影响全身自主神经系统、内分泌系统以及可能对失调的脑功能有重整作用,进而发挥对心血管系统的调整作用。

针刺干预血压动物实验始自上世纪60年代,彼时早有实验证实针刺有使异常心血管活动趋于正常的作用[1]。针刺具有抗休克升压作用[2],但机理研究尚十分缺乏。早期的实验结果表明电针对实验性高血压的降压效应主要是交感缩血管中枢紧张性受抑制,使外周血管舒张而产生的,此种抑制效应与电针时中枢产生的内源性鸦片样物质有关。这提示针刺降血压的机制存在于中枢。Peng Li及John C.Longhurst等通过大量的实验验证发现在脑内存在一个长的环路参与电针心血管效应,此环路主要包括下丘脑弓状核、中脑导水管腹侧前区灰质中脑等[3]。研究表明调控血压和心率的是个自大脑皮层至脊髓的广泛而复杂、不同层级的神经网络。而针刺对中枢的作用范围也相当广泛,应不仅限于以上核团。海马组织是边缘系统重要核团、应激调控的高级中枢,但也有诸多文献表明其与心血管基本中枢下丘脑、孤束核、延髓等也有着复杂的跨突触联系[4]。

有文献指出海马背侧主要参与完成学习记忆等认知功能;而海马腹侧主要参与完成调节内分泌、自主神经等功能[5]。采用急性限制应激法可以急性升高血压、心率,有实验采用非特异性的突触抑制剂CoCl2微量注射入海马背侧和腹侧,发现其均可抑制这种升高的血压、心率。这说明在应激状态下海马可能也是主要的参与心血管调控的主要中枢。临床也有报道快速动眼睡眠期(REMS)海马theta节律电振荡与心电R波相位锁定呈正相关,这提示海马组织可能在某些状态下是心率的计时器[6]。通过记录延髓单位放电、海马单位放电及场电、心电,Marisa Pedemonte等发现在REMS,海马对心率调制作用可能是通过对延髓等基本中枢调制实现的,记录的大多数单位放电都与海马theta振荡有相位锁定关系[7]。也有通过直接的采用theta节律的电流刺激海马,发现心率轻度增加[8],有实验通过对海马腹部注射海仁酸诱发颞叶癫痫,并同步记录迷走神经及颈丛交感神经放电,发现这两者均有激活[9]。故海马的theta振荡可能对全身的自主神经的活动,包括迷走神经和交感神经,以及各不同部位的交感神经的协作有重要调控作用。

这均提示海马组织参与全身自主神经系统的调制整合,其也对心率有重要作用,进而发挥调控血压的作用。针刺具有良好的抗应激作用,针刺信息也能作用于大脑海马组织[10-11]，海马功能参与了诸多针刺效应,但其是否参与针刺调整心血管活动尚不明了。

近年来,脑内海马网络功能研究颇为深入。其功能状态可通过网络层次的场电活动表现出来,主要包括3种特征性的场电,即4～12 Hz的theta电振荡、1 Hz左右的慢波振荡以及中间过渡性大幅度的不规则电活动(large irregular activity,LIA)[12]。本研究主要采用电生理学方法记录海马场电活动结合海马单位放电,观察其在电针对异常心血管活动调整中的作用。

1　材料与方法

1.1实验动物和分组

雄性Sprague-Dawley大鼠39只(180～250 g),由上海中医药大学动物实验中心提供。分3组,乌拉坦正常麻醉组15只,乌拉坦加强深麻醉组9只,正常麻醉肛管加压组15只。3组均记录股动脉血压、心电和海马场电、细胞放电,正常麻醉组没有干预措施,后两组采取电针干预。正常麻醉是20%乌拉坦腹腔注射麻醉(1 g/kg),另加2～5 mL阿托品(0.5 mg:30 mL)抑制口腔气管内唾液分泌,深麻醉组是在正常麻醉组基础上追加2～5 mL(20%)乌拉坦,以观察到麻醉血压接近60 mmHg为准。

1.2外科手术与电极置入

分离右侧股动脉,采用静脉输液针(规格0.55 mm ×20 cm)与压力换能器(YPJ01型,成都仪器厂)相连,充以肝素化生理盐水后插入股动脉,结扎固定。将动物固定在SN-2型脑立体定位仪(Narishige,Japan)上,打开颅骨,挑开硬脑膜,用4%生理盐水琼脂封闭骨窗。单极玻璃电极丝(阻抗1～3MW)用于记录海马场电。根据大鼠脑立体定位图谱(Paxinos and Waston等,诸葛启钏主译,2005),将记录场电的玻璃微电极置于左则海马CA1。右侧海马CA1区玻璃电极用来记录细胞放电,玻璃微电极内均充灌含有0.5 mol/L醋酸钠的2%滂胺天蓝溶液,电极尖端约1mm,阻抗10～20MW。玻璃微电极尖端:双侧海马CA1区,P:﹣3 mm,R或L:2.5 mm,H:3 mm。动物体温维持在37℃左右。将一规格为0.25 mm×13 mm针灸针置于右后肢足三里(参考林文注、王佩主编《实验针灸学》),具体定位为膝关节后外侧,在腓骨小头下约5 mm处,刺入深度约为7 mm,另一同样规格针灸针置于附近约2 mm处,用作电流引出电极。针灸针连接入生物信号采集系统自带刺激器。

1.3心电图记录

采用标准肢体导联Ⅱ,将针灸针分别插入左后腿、左前腿、右前腿,以记录黑线连接左后腿,红线连接左前腿,绿线连接右前腿。软件设置为记录三通道,参数设定为记录电压为200mV,时间常数0.2 s,低通滤波100 Hz。

1.4肛管-直肠加压

加压球囊为自制球囊,将安全套橡胶固定于硅胶管,后端连接三通管,加压时连接于血压计,用于监控加压大小,一般加压约40 mmHg。球囊插入肛管约2 cm,硅胶管外部用医用胶布固定于大鼠尾巴。探测样本血压稳定升高10 mmHg以上,才正式开始电针实验。

1.5电针刺激与记录

神经元放电经微电极测头、微电极放大器(SWF-2W 型,成都仪器厂)放大后输入RM6240C生物信号采集系统(成都仪器厂),记录时时间常数 0.001 s,高频滤波1 KHz。场电直接输入此系统,时间常数0.2 s,高频滤波300 Hz。由此系统自带刺激输出经大鼠足三里穴位刺激,所用刺激参数为串单刺激,5～10 V,波宽0.5 ms,每串30个脉冲,刺激频率为2.5 Hz。所记录信息存储在电脑上进行后期处理。

1.6电极尖端的组织学鉴定

实验结束后用滂胺天蓝法对玻璃微电极进行定位。用0.9%NaCl 100 ml和4%甲醛溶液100 ml对动物进行左心室灌流后取脑。4℃下保存1星期后进行石蜡包埋、切片和HE染色。光学显微镜下鉴定电极尖端的位置,将符合定位要求的实验资料作统计学处理。

1.7资料分析

存储在电脑中的实验资料,在RM6240C实验系统自带分析处理软件中对生物放电信号形式、放电频率等进行初期处理,结合目测法对场电进行分析,场电采用生物信号系统自带傅利叶频谱分析软件分析,以生物信号采集系统对心电RR波峰间隔(RR interval, RRI)自动采样分析作散点图分析。所有小样本数据用t-test检测是否具有统计学意义。

2　结果

2.1正常麻醉组

图1A中所示海马细胞放电、场电及血压周期性交替;B中所示为A中虚线框内放大部分,显示海马细胞放电、场电的两种状态;C为B中场电a、b部分场电频谱,显示为1 Hz(慢波范围)和5 Hz(theta范围);D显示A中心电R波峰间隔也呈周期性波动;E显示D中心率由慢向快转折时场电为5 Hz左右theta振荡且theta振荡较血压心电改变提前(1.79±0.22)s。

麻醉状态大鼠血压[(102±11.4)mmHg/(78 ±13.5)mmHg,n=15]较正常值(120/90 mmHg)偏低。海马场电的特征性振荡都已记录出,主要为约1 Hz(慢波)及约5 Hz(theta)振荡,不同时期细胞放电特征不一样,theta期放电明显增加(见图1A、B),海马场电、细胞放电呈周期性交替。通过对正常海马网络的场电、细胞放电与股动脉记录血压的相关性目测分析发现,海马场电波动时,血压也有明显改变,theta期血压较非 theta期血压低[(13.6±3.3)mmHg,n=15],见图1A。对心电RRI进行分析,发现乌拉坦麻醉大鼠心率也呈周期性波动,图1D、E显示海马场电由慢波转theta时,心率加快。

2.2乌拉坦加强深麻醉组

图2A中各栏同图1,图中标记为电针。深麻醉时血压偏低[(61.2±5.23)mmHg],多次电针后血压升高[(90.2±1.48)mmHg,P＜0.001];B为A中虚线框内放大,场电显示电针前为慢波,电针后为theta振荡;C 为B中电针前后心电图RR波峰间隔图显示电针后心率加快。

深麻醉大鼠测得血压偏低[(61.2±5.23)mmHg, n=9],多串电针后血压升高[(90.2±1.48)mmHg,P＜0.001],海马场电仍呈周期性交替,在场电为慢波时电针诱发theta振荡,伴有心率加快,见图2C,而在theta期电针则场电无明显变化,见图2A。

2.3正常麻醉肛管加压组

图3A中各栏同图1,图中标记为电针。加压后血压约升高(15.26±2.35)mmHg,电针干预时血压下降明显[(9.73±1.44)mmHg,P＜0.001];B为A中实线部分放大,显示肛管加压诱发血压升高,且海马场电显示为theta振荡;C为A中虚线部分放大,显示电针时血压下降且海马theta相关细胞放电增加;D为A中心电图RR波峰间隔散点图,红色标记电针刺激,绿色标记肛管减压,显示肛管加压时心率加快,而电针时心率减慢。

肛管加压诱发血压稳定升高幅度约为(15.26± 2.35)mmHg(n=15),电针干预时血压下降明显,幅度为(9.73±1.44)mmHg,P＜0.001,见图3。图3A、B显示肛管加压会诱发theta振荡,伴theta相关细胞放电增强,图3D显示此过程伴随心率明显增加,故可能交感兴奋明显。图3A、C也显示电针时theta相关细胞放电也增强,故电针在肛管加压时仍能激活海马网络,图3D也显示电针时心率较前下降,故电针可能是增强了心迷走功能。

3　讨论

近年来有研究发现乌拉坦麻醉大鼠是个很好的睡眠模型[13]。乌拉坦尽管是常用的麻醉剂,但事实上其麻醉机理仍然不清楚。乌拉坦非一般性经典麻醉剂,有研究指出乌拉坦的作用主要是调制静息状态钾电导进而使神经元超极化降低兴奋性[14]。

Clement等系统研究发现乌拉坦麻醉大鼠脑电会出现周期性的脑电交替,这种交替的脑功能状态与自然睡眠状态相似,且监测肌电、体温、呼吸等生理指标也与睡眠状态相似。本研究也发现乌拉坦麻醉大鼠海马场电也出现周期性的脑电交替且伴随有心血管活动的周期性波动现象。且海马特征性场电theta振荡与心率加快相关,与特征性快速动眼睡眠期(Rapid Eye Movement Sleep,REMS)相似,但血压却是下降,有学者指出在REMS期全身交感活动不一致,肾交感活动明显抑制,而外周交感活动明显增加,故中心动脉压升高,而外周动脉压下降[15-16]。

图1　正常麻醉组

图2　乌拉坦加强深麻醉组

图3　正常麻醉肛管加压组

针刺可以疏通经络,通调气血,调整阴阳,通过多途径影响全身自主神经系统、内分泌系统以及可能对失调的脑功能有重整作用,进而通过这些神经通路发挥其调整异常心血管活动的作用。临床研究也显示电针有升高麻醉状态下低血压作用,有资料显示穴位电针刺激能降低麻醉过程中低血压所造成的血流动力学改变[17]。也有通过经皮穴位电刺激加复合药物在全麻下行对犬进行控制性降压,术后电刺激组较非电刺激组麻醉低血压回升时间明显缩短[18]。

胡旭初等[1]报道用静脉内匀速注射药物造成动物血压异常时,针刺可使血压异常状态趋于正常化。马如纯等[2]实验也表明针刺具有抗休克作用。肖永福等[19]采用硝普钠造犬低血压后电针,也发现血压升高。我们的结果表明海马theta振荡在电针后激活,文献提示theta激活通路也有上行乙酰胆碱系统参与[20],故我们的实验结果也印证了包括胆碱能系统在内上行激动系统也参与了电针升压的作用。

海马组织被认为是参与产生theta节律最主要的脑结构[21]。Theta节律发现的历史已有几十年,但其产生的机制以及环路仍未完全明了。在脊椎动物,活动的大脑常伴随着较高水平的胆碱能活动,以及皮质去同步化和海马theta节律[22]。Theta振荡的确切意义还不是很清楚。有资料表明其与学习记忆有关,也有资料表明海马theta振荡与感觉运动整合有关[23],视觉和听觉也能诱发theta电振荡。Theta振荡是如此常见,它可能是海马网络的基本工作状态。文献以及我们的记录结果均显示REMS期海马theta振荡出现且伴随心率加快、外周交感模式切换而导致血压改变,海马电活动的改变较心血管活动改变提前提示心血管活动是继发于中枢改变。我们的结果也表明了电针在深麻醉及肛管加压两种状态下是可以激活海马theta振荡,且此过程伴随着异常心血管活动趋于正常的表现,故海马theta振荡可能参与了电针对心血管活动双向调节作用。有工作通过对海马腹部注射海仁酸并同步记录迷走神经及颈丛交感神经发电,发现这两者均有激活。故海马的theta振荡可能对全身的自主神经的活动,以及各不同部位交感神经的协作有重要调控作用。海马theta振荡参与电针的心血管双向调整作用可能即是通过对外周自主神经的整合实现的,由于本研究只记录了海马网络电活动,故不排除还存在其他电针双向调节中枢。

参考文献

[1]胡旭初,陈蕙玲,卢希正,等.针刺引起的血压异常状态正常化现象及若干有关观察[C].上海市科学技术论文选集,1960:Ⅱ 32-44.

[2]马如纯,侯正光,何学道,等.针刺人中的抗休克作用及其血流动力学特点[J].针刺研究,1980,5(1):57-63.

[3]Peng Li.Longhurst.An arcuate-ventrolateral periaqueductal gray reciprocal circuit participates in electroacupuncture cardiovascular inhibition[J].Auton Neurosci,2010,158(1-2):13-23.

[4]Herman JP,Mueller NK.Role of the ventral subiculum in stress integration[J].Behav Brain Res,2006,174(2):215-224.

[5]Scopinho AA.Dorsal and ventral hippocampus modulate autonomic responses but not behavioral consequences associated to acute restraint stress in rats[J].PLoS One,2013,8(10):77750.

[6]Pedemonte M,Rodríguez A,Velluti RA,et al.Hippocampal theta waves as an electrocardiogram rhythm timer in paradoxical sleep[J]. Neurosci Lett,1999,276(1):5-8.

[7]Pedemonte M.Temporal correla-tions between heart rate,medullary units and hippocampal theta rhythm in anesthetized,sleeping and awake guinea pigs[J].Auton Neurosci,2003,107(2):99-104.

[8]Aitake M,Hori E,Matsumoto J,et al.Sensory mismatch induces autonomic responses associated with hippocampal theta waves in rats[J].Behav Brain Res,2011,220(1):244-253.

[9]Sakamoto K,Koizumi K,Stewart M.Kainic acid seizure-evoked parasympathetic and sympathetic nerve activity and altered baroreceptor reflex responses in urethane-anesthesized rats[J].International Congress Series,2005,1278:419-422.

[10]Bae CH,Kim DS,Jun YL,et al.Proteomic analysis of the effect of acupuncture on the suppression of kainic acid-induced neuronal destruction in mouse hippocampus[J].Evidence-Based Complement Alternat Med,2013:436315.

[11]侯良芹,刘嵩,熊克仁.电针对创伤后应激障碍模型大鼠海马神经元型一氧化氮合酶表达的影响[J].中国针灸,2013,33(7):632-636.

[12]Wolansky T,Clement EA,Peters SR,et al.Hippocampal slow oscillation:a novel EEG state and its coordination with ongoing neocortical activity[J].J Neurosci,2006,26(23):6213-6229.

[13]Clement EA.Cyclic and sleep-like spontaneous alternations of brain state under urethane anaesthesia[J].PLoS One,2008,3:2004.

[14]Sceniak MP.Cellular actions of urethane on rat visual cortical neurons in vitro[J].J Neurophysiol,2006,95(95):3865-3874.

[15]Miki K,Oda M,Kamijyo N,et al.Lumbar sympathetic nerve activity and hindquarter blood flow during REM sleep in rats[J].J Physiol, 2004,557(Pt1):261-271.

[16]Yoshimoto M,Yoshida I,Miki K.Functional role of diverse changes in sympathetic nerve activity in regulating arterial pressure during REM sleep[J].Sleep,2011,34(8):1093-1101.

[17]Sahmeddini MA,Eghbal MH,Khosravi MB,et al.Electroacupuncturestimulationatacupointsreducedtheseverityof hypotensionduringanesthesiainpatientsundergoingliver transplantation[J].JAcupunct Meridian Stud,2012,5(1):11-14.

[18]方剑乔,周传龙,邵晓梅,等.经皮穴位电刺激复合药物全麻行控制性降压对心脏的保护效应[J].中国针灸,2011,31(7):625-629.

[19]肖永福,林树新,邓子夫,等.硝普钠造成犬低血压时电针升压作用的机制分析[J].生理学报,1983,35(3):257-263.

[20]Smythe JW.The extrinsic modulation of hippocampal theta depends on the coactivation of cholinergic and GABA-ergic medial septal inputs[J].Neurosci Biobehav Rev,1992,16:289-308.

[21]Bland BH,The physiology and pharmacology of hippocampal formation theta rhythms[J].Prog.Neurobiol,1986，26:1-54.

[22]Zhang H,Lin SC,Nicolelis MAL.Spatiotemporal coupling between hippocampal acetylcholine release and theta oscillations in vivo[J].J Neurosci,2010,30(40):13431-13440.

[23]Jeremy BC,Joseph Rmadsen,Andreas SB,et al.Humanqoscillations related to sensorimotor integration and spatial learning[J].J Neurosci, 2003,23(11):4726-4736.

【中图分类号】R2-03

【文献标志码】A

DOI:10.13460/j.issn.1005-0957.2016.04.0466

文章编号:1005-0957(2016)04-0466-06

收稿日期2015-08-20

基金项目:上海市教委预算内项目(2013JW04)

作者简介:董献文(1980-),男,讲师,Email:xianwen.2004@163.com

Study of the Involvement of Hippocampal Network Theta Oscillations in Electroacupuncture Regulation of Abnormal

Cardiovascular Activities

DONG Xian-wen,XU Ying.
Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Shanghai 201203,

China

[Abstract]ObjectiveTo observe changes in hippocampal network electrical activities in electroacupuncture regulation of abnormal cardiovascular activities and explore the central mechanism of the regulation.MethodExperimental rats were randomized into three groups:normal urethane anesthesia without electroacupuncture(n=15),urethane enhanced deep anesthesia (n=9)and normal anesthesia plus anal canal pressurization(n=15).Femoral arterial pressure,cardiac electricity,hippocampal field potentialsandcellulardischargewererecordedinthethreegroups.Thenormalanesthesiagroup didnotreceive intervention measures.The other two groups received acupuncture intervention after successful induction of abnormal blood pressure. ResultIn rats with normal urethane anesthesia,sleep-like periodic hippocampal electrical activity occurred with periodic cardiovascular activities and theta oscillations was corresponding to increased heart rates.In rats with deep anesthesia and hypotension,theta oscillations appeared in hippocampal network with increased blood pressure and heart rates after electroacupuncture(P＜0.001).Anal canal pressurization induced increases in blood pressure and heart rates and caused theta oscillations in hippocampal network.During that time,electroacupuncture could still activate theta-related cells,reduce blood pressure and decrease heart rates(P＜0.001).ConclusionTheta oscillations in hippocampal network are involved in the bidirectional regulating effect of electroacupuncture on abnormal cardiovascular activities.

[Key words]Neural network;Theta oscillation;Electroacupuncture;Hippocampus;Blood pressure;Rats