氢生理盐水对对乙酰氨基酚致小鼠急性肝损伤的保护作用

王德仙，沈伟峰，栗玉龙，杨诚，杨甲梅



·论著 基础研究·

氢生理盐水对对乙酰氨基酚致小鼠急性肝损伤的保护作用

王德仙，沈伟峰，栗玉龙，杨诚，杨甲梅

（第二军医大学东方肝胆外科医院 特需治疗科，上海 200433）

［摘 要］目的 观察氢生理盐水对对乙酰氨基酚致小鼠急性肝损伤的保护作用。方法 30只雄性BALB/C小鼠随机分成3组：对照组、模型组和治疗组，每组10只。治疗组和模型组同时给予对乙酰氨基酚500 mg/kg腹腔内注射诱发小鼠急性肝损伤，1 h后治疗组每3 h腹腔注射氢生理盐水6 mL/kg，模型组给予相同剂量的生理盐水；对照组各时间点均腹腔注射相同剂量的生理盐水。所有动物在给予对乙酰氨基酚后24 h处死，测定血浆谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）水平，以及肝组织匀浆丙二醛（MDA）和还原型谷胱甘肽（GSH）含量，TUNEL法检测肝细胞凋亡指数，观察肝组织病理学改变和肝细胞坏死程度。结果 氢生理盐水能显著降低对乙酰氨基酚致小鼠急性肝损伤的血浆ALT［（816.3±300.2）U/L vs（3 933.0±1 112.0）U/L，P＜0.01］、AST［（403.8±83.6）U/L vs（2851.0±992.9）U/ L，P＜0.01］水平，显著抑制炎症因子TNF-α［（3.54±0.42）pg/mL vs（6.58±0.72）pg/mL，P＜0.01］、IL-6［（350.20±66.67）pg/mL vs （553.10±67.73）pg/mL，P＜0.05］的生成和MDA［（5.89±0.81）nmol/mL vs （8.26±0.60）nmol/mL，P＜0.05］的含量，并增加GSH［（362.8±37.9）μg/mL vs （230.8±53.1）μg/mL，P ＜0.05］储备，明显降低肝细胞凋亡指数［（5.67%±2.28%） vs （1.93%±0.82%），P＜0.01］，显著改善肝组织病理学变化和降低肝细胞坏死的严重程度［（2.9±0.74） vs（1.7±0.82），P＜0.01］。结论 氢生理盐水对对乙酰氨基酚致小鼠急性肝损伤具有明显的保护作用。

［关键词］氢生理盐水；对乙酰氨基酚；肝损伤；保护作用；小鼠

对乙酰氨基酚是引起药物性肝损伤最常见药物，在美国、西欧，占成人急性肝损伤的病例的50%左右［1］；在我国，对乙酰氨基酚引起的肝损伤占所有药物性肝损伤3.99%［2］。氢气是世界上已知的密度最小的气体，2007年Ohsawa等［3］证明吸入2%氢气能明显抑制大鼠脑部的局部缺血再灌注损伤或炎症损伤，提示氢气作为一种抗氧化剂在预防和治疗的应用潜力。我们将氢气在高压（0.4 MPa）下溶于生理盐水中制成的浓度大于0.6 mmol/L氢生理盐水（hydrogen-rich saline，HS），使用更加安全和方便。本研究通过检测血浆谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草转氨酶（asparate aminotransferase，AST）及肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）的水平，肝组织匀浆丙二醛（malondialdehyde，MDA）和还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）的含量，检测肝细胞凋亡指数，观察肝组织病理学改变和肝细胞坏死程度，评估氢生理盐水对对乙酰氨基酚诱导小鼠急性肝损伤的保护作用。

1 材料和方法

1.1 实验动物

雄性BALB/C小鼠，体重在20～25 g，上海中国科学院实验动物研究中心培育，购自第二军医大学实验动物中心。实验之前，所有动物饲养在清洁，空气新鲜的空调房间，定时打扫并通风换气，温度在20 ℃左右，相对湿度50%～60%，昼夜12 h∶12 h，在整个实验期间自由摄取食物和水。

1.2 药物和试剂

氢生理盐水由第二军医大学海军研究所提供，现用现配，其制备方法如文献［4］所述；对乙酰氨基酚（合肥博美生物科技有限责任公司，纯度≥98%，批号：DA9022-100 g）；MDA及GSH试剂盒（合肥博美生物科技有限责任公司，批号分别为：ELS-4834、ELS-1745）；TNF-α及IL-6试剂盒（浙江联科生物技术有限公司，批号分别为：70-E-EK2822、70-EEK2062）。

1.3 仪器

电子天平（PL602-L，中国）；7600-020全自动生化分析仪（HITACHI，日本）；酶标仪（BioTek，美国）；匀浆器（PRO200，美国）；浸蜡包埋机（LEICA EG 1150E/C，德国）；光学显微镜（LEICA CTR MIC，德国）。

1.4 动物分组

将30只雄性BALB/C小鼠随机分成3组：对照组、模型组和治疗组，每组10只。模型组和治疗组同时给予对乙酰氨基酚500 mg/kg腹腔内注射诱发小鼠急性肝损伤，1 h后治疗组每3 h腹腔注射氢生理盐水6 mL/kg，模型组给予相同剂量的生理盐水；对照组各时间点均腹腔注射相同剂量的生理盐水。所有动物均在腹腔内注射对乙酰氨基酚24 h后，同时眼球取血用于测定血浆生化指标，剖腹取出肝脏以制备肝组织匀浆用于相关检查。

1.5 指标测定

俄罗斯北部地区是俄罗斯13个旅游区中面积最大的，人口最多的是伏尔加沿岸及中央旅游区，其中西部、北部、高加索、乌拉尔都是著名的旅游景区，开发最早的是亚速海-黑海之间的部分区域。俄罗斯南部主要是亚速海-黑海沿岸的主要旅游区，这里四季如春，属于亚热带区域。俄罗斯人旅游易选择海滨城市，每年来此度假旅游、疗养过冬的游客达数百万人。俄罗斯最大的海滨疗养胜地索契，罪域俄罗斯黑海附近，有俄罗斯最大的温泉，是俄罗斯旅游必去的地方。这里有丰富的海域资源，200公里的海岸线有50多价疗养机构，每天来这里疗养的游客占总游客的80%。

1.5.1 血浆ALT、AST检测：对乙酰氨基酚处理24 h后摘除小鼠眼球取血，静置10 min，4 500 r/min离心10 min取血浆，立即用全自动生化检测仪检测血浆ALT和AST。

1.5.2 TNF-α和IL-6测定：检测前取出贮存于-20 ℃冰箱中的血浆标本，缓慢恢复至室温，轻柔地混匀，常温离心5 min取上清液50 μL，两者均采用ELISA法，根据产品试剂盒提供的操作说明进行操作，操作完成后30 min内用酶标仪在450 nm波长处准确读取各孔的吸光值，再根据标准曲线计算出对应样品的浓度。

1.5.3 MDA和GSH测定：检测前准确称取肝组织重量，按重量体积比为1∶19加入生理盐水制备成5%肝组织匀浆后，两者均采用ELISA法，根据产品试剂盒提供的操作说明进行操作，操作完成后立刻用标准酶标仪在450 nm波长处准确读取各孔的吸光值，再根据回归方程计算出对应样品的浓度。

1.5.4 肝组织TUNEL染色分析：制作的石蜡切片进行脱蜡、水化后，根据制造商的提供的操作说明进行操作，操作完成后在200倍光学显微镜下计算肝细胞凋亡指数。

1.5.5 肝组织病理学检查：取小鼠肝左外侧叶，修剪后成大小约1 cm×1 cm（厚度不超过0.5 cm）置入4%福尔马林溶液中，固定24 h，常规浸蜡包埋、切片、HE染色。光镜下观察肝组织病理学变化，肝细胞坏死程度分级参照文献［5］。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 氢生理盐水对各组小鼠实验指标的影响

与对照组比较，模型组小鼠血浆ALT、AST、TNF-α、IL-6水平均显著升高（P＜0.01）；肝组织MDA水平明显升高（P＜0.05）；肝组织GSH水平显著降低（P＜0.01）。与模型组比较，治疗组小鼠血浆ALT、AST、TNF-α水平均显著降低（P＜0.05）；血浆IL-6和肝组织MDA明显降低（P＜0.05）；肝组织GSH水平明显升高（P＜0.05）。详见表1。

2.2 氢生理盐水对小鼠肝细胞凋亡指数的影响

每个TUNEL染色切片在200倍光学显微镜下随机观察一个视野，并至少计数500个细胞，棕色染色细胞为凋亡细胞，凋亡细胞阳性率即为凋亡指数，如图1所示。肝细胞凋亡指数在模型组和治疗组分别为［（5.67%±2.28%）vs（1.93%±0.82%），P＜0.01］。

表1　各组实验指标比较

2.3 氢生理盐水对小鼠肝组织病理学和肝细胞坏死程度的影响

2.3.1 氢生理盐水显著改善肝组织病理学变化：每个HE染色切片在100倍和400倍光学显微镜下观察。光镜下显示对照组小鼠肝细胞排列整齐，肝细胞索走向清晰，围绕中央静脉呈辐射状排列，肝小叶结构完整，无病理学改变（图2 NS）；而对乙酰氨基酚使小鼠肝细胞出现空泡和灶性坏死，肝小叶窦间隙明显扩大，肝细胞索走向紊乱，围绕肝中央静脉周围可见大片坏死，细胞核固缩、破碎、部分溶解（图2 AP+NS）；氢生理盐水治疗后，小鼠肝细胞变性、坏死明显减轻，肝组织病变改善明显（图2 AP+HS）。

2.3.2 氢生理盐水显著降低肝细胞坏死程度：根据肝细胞坏死面积，将肝细胞坏死程度被分为0～4级［5］，即：0级，没肝细胞坏死面积小于5%；1级，镜下肝细胞坏死面积达到5%～30%；2级，镜下肝细胞坏死面积达到30%～50%；3级，镜下肝细胞坏死面积达到50%～70%；4级，镜下肝细胞坏死面积超过70%。每个切片用100倍下随机观察一个视野，模型组和治疗组肝细胞坏死程度分别为［（2.9±0.74）vs（1.7± 0.82），P＜0.01］。

NS：对照组；AP+NS：模型组；AP+HS：治疗组；黑箭头所示凋亡细胞，CV示中央静脉图1 各组小鼠肝脏TUNEL染色结果

3 讨论

对乙酰氨基酚是世界上使用最广泛的非处方类解热镇痛药，主要用于普通感冒或流行性感冒引起的发热，也可用于缓解轻至中度疼痛如头痛、关节痛、肌肉痛等。对乙酰氨基酚是典型的剂量依赖性肝损伤药物，在大剂量长期应用或某些特殊情况下（如过量饮酒、饥饿、免疫力低下等）过量服用则能引起肝细胞坏死，甚至引起急性肝功能衰竭。在治疗剂量（10～15 mg/kg）时，对90%以上乙酰氨基酚与硫酸盐和葡萄糖酸结合而排出，仅小部分通过单加氧酶系的氧化反应而生成中间代谢产物N-乙酰-对-苯醌亚胺（NAPQI），NAPQI再与GSH结合生成无毒的硫醇尿酸而排出［6］；当超过治疗剂量时，硫酸盐和葡萄糖醛酸途径被完全饱和，氧化生成的NAPQI增加，致细胞内的GSH储备减少，使大量的NAPQI聚积［7］。生成过多的NAPQI可与细胞内大分子如核酸、蛋白质共价结合，干扰线粒体和细胞核的功能，生成大量的氧自由基，导致体内氧化与抗氧化系统失衡，最终导致肝细胞的死亡［8］。实验研究证明氢生理盐水不仅在脑部缺血再灌注损伤有保护作用［9］，而且在心［10］、肝［11］、肾［12］等缺血再灌注损伤及炎症损伤同样具有治疗作用。

ALT和AST是肝内的主要功能酶，是从损伤或坏死的肝细胞浆或线粒体中释放到血液中，是反映肝细胞损伤的灵敏指标［13］。实验发现在模型组中血浆的ALT和AST的水平显著升高，镜下肝细胞坏死面积均在30%以上，证明了肝功能损害严重；用氢生理盐水治疗后，血浆的ALT和AST的水平显著下降，镜下肝细胞坏死面积显著降低，证明了氢生理盐水能降低对乙酰氨基酚造成的肝细胞坏死面积，能保护肝脏功能。

TNF-α主要由单核细胞/巨噬细胞分泌，它的浓度与机体的炎症严重程度正相关，是炎症细胞因子网络的关键［14］；IL-6是人类最早发现的细胞因子，是炎性介质网络的主要成分，在炎症反应中起重要作用［15］。我们检测血清中的TNF-α、IL-6的含量达到判别病情严重程度和判断药物的治疗效果。在模型组中，血浆的TNF-α、IL-6的水平显著升高，证明对乙酰氨基酚可引起肝脏炎症反应；而治疗组中，TNF-α、IL-6的水平显著降低，证明了氢生理盐水能抑制肝脏炎症反应，保护肝组织免受对乙酰氨基酚的炎症性损伤。

MDA来源于脂质发生过氧化反应的终产物，是氧化应激的标志物，MDA含量可间接反映机体抗氧化能力及清除氧化产物的能力［16］。GSH是体内的内源性还原剂，能与多种外源性、内源性有毒物质结合生成减毒物质，避免各种有害刺激，如氧化应激、炎症等对细胞造成的损害［17-18］。实验发现：氢生理盐水不仅能显著降低小鼠血浆肝组织MDA的含量，而且能减轻肝组织GSH的消耗并增加其储备，证明了氢生理盐水不仅能抑制脂质过氧化反应，而且能抑制氧化应激反应，从而减轻对乙酰氨基酚对肝脏的氧化反应性损伤。

总之，氢生理盐水作为一种抗氧化剂，治疗对所致小鼠的急性肝损伤，能明显的改善肝功能、抑制肝脏炎症反应、抑制脂质过氧化反应及氧化应激反应程度、减轻肝组织GSH的消耗并增加其储备、降低肝细胞凋亡指数、明显改善肝组织病理学变化及减轻肝细胞坏死程度，对对乙酰氨基酚所致小鼠的急性肝损伤具有保护作用。

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（本文编辑：张海燕，鲁翠涛）

［中图分类号］R575.3

［文献标识码］A

Doi:10.11952/j.issn.1007-1954.2016.04.006

［收稿日期］2016-01-08

［第一作者简介］王德仙（1982-），男，安徽芜湖人，住院医师，硕士。

［通讯作者简介］杨甲梅，教授，E-mail：jmyang@smmu.edu.cn。μg/mL vs （230.8±53.1） μg/mL， P＜0.05］. In addition， HS could markedly decrease the hepatocellular apoptosis index ［（5.67±2.28）% vs （1.93±0.82）%， P＜0.01］， ameliorate the liver histopathology and diminish the degree of hepatocyte necrosis ［（2.9±0.74） vs （1.7±0.82）， P＜0.01］. Conclusion The hydrogen-rich saline has a protective role against acetaminophen-induced liver injury in mice.

Protective effect of hydrogen-rich saline against acetaminophen-induced liver injury in mice

WANG De-xian， SHEN Wei-feng， LI Yu-long， YANG Cheng， YANG Jia-mei. Department of Special Treatment，Eastern Hepatobiliary Surgery Hospital， Second Military Medical University， Shanghai 200438， China

Abstractobjective To investigate the protective effect of hydrogen-rich saline （HS） against acetaminophen-induced liver injury in mice. Methods Thirty BALB/C male mice were randomly divided into three groups: control group， model group， and treatment group， each group contained 10 mice. In the treatment group and model group， liver injury was induced by acetaminophen （i.p. 500 mg/kg）. One hour after the administration of acetaminophen， HS （6 mL/kg） or an equivalent volume of NS was given intraperitoneally every 3 h. The control group was injected with the same dose of normal saline at the corresponding time point. All animals were killed at 24 h after the administration of acetaminophen， the levels of plasma alanine aminotransferase （ALT）， asparate aminotransferase （AST）， tumor necrosis factor alpha （TNF-α）， interleukin-6 （IL-6）， the contents of malondialdehyde （MDA） and glutathione （GSH） in the liver tissue were measured； the hepatocellular apoptosis index was detected by TUNEL method； the pathological change of liver tissue and the necrosis area of hepatic cell were observed.

Results In the acetaminophen-induced liver injury in mice， HS could significantly reduce the levels of plasma ALT ［（816.3±300.2） U/L vs （3 933.0±1 112.0） U/L， P＜0.01］ and AST ［（403.8±83.6） U/L vs （2 851.0±992.9） U/ L， P＜0.01］， inhibit the generation of inflammatory factors TNF-α ［（3.54±0.42） pg/mL vs （6.58±0.72） pg/mL，P＜0.01］ and IL-6 ［（350.20±66.67） pg/mL vs （553.10±67.73） pg/mL， P＜0.05］， and decrease the content of the MDA ［（5.89±0.81） nmol/mL vs （8.26±0.60） nmol/mL， P＜0.05］ and increase the reservation of GSH ［（362.8±37.9）

Key wordshydrogen-rich saline； acetaminophen； liver injury； protective effect； mice