环烯醚萜对烟酰胺-链脲霉素诱导的2型糖尿病小鼠生精功能的影响

陈彤

环烯醚萜对烟酰胺-链脲霉素诱导的2型糖尿病小鼠生精功能的影响

陈彤

摘要：目的探讨环烯醚萜对烟酰胺-链脲霉素诱导的2型糖尿病小鼠生精功能的影响。方法56只雄性小鼠随机均分为7组（n=8）：对照组；糖尿病组；糖尿病小鼠服用格列本脲（0.25 mg/kg）治疗组；糖尿病小鼠接受环烯醚萜（20和40 mg/kg）治疗组；正常小鼠接受环烯醚萜（20和40 mg/kg）治疗组。糖尿病模型制作，由腹腔注射链脲霉素65 mg/kg，15 min后注射烟碱120 mg/kg，然后，连续喂服格列本脲和环烯醚萜28 d。最后1次治疗24 h后，提取各组血清样本、睾丸及附睾组织，测定血激素、观察睾丸病理切片、进行精子参数评估。结果环烯醚萜40 mg/kg和格列本脲治疗可以恢复糖尿病引起的小鼠体质量减少（P＜0.05）；糖尿病组小鼠附睾的精子浓度和存活率显著低于对照组，糖尿病+环烯醚萜40 mg/kg组的精子浓度和存活率显著高于糖尿病组，糖尿病+格列本脲组比糖尿病组的小鼠精子浓度增高（均P＜0.05）；糖尿病组小鼠与对照组相比血清黄体生成素（LH）、卵泡刺激素（FSH）、睾酮（T）水平显著降低，环烯醚萜40 mg/kg和格列本脲可提升糖尿病动物的血清LH、FSH、T水平（均P＜0.05）。结论环烯醚萜可降低糖尿病小鼠氧化损伤的危重程度，有效提升其生育能力。

关键词：糖尿病，2型；环烯醚萜类；促黄体激素；卵泡刺激素；睾酮；精子；小鼠,近交C57BL；抗氧化作用

最新的预计表明，到2030年，全世界将有2.8亿人面临糖尿病的威胁，且绝大部分是2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）［1］。此外，男性不育是人类社会面临的又一重要难题。世界范围内，不孕不育夫妇比例占总数的1/7，其中大约有50%的病因归因于男性［2］。生精功能障碍是糖尿病最重要的并发症之一，约90%的糖尿病男性会面临生育能力下降的问题，其中25%的T2DM患者伴有继发性性腺功能减退，4%伴有原发性性腺功能减退［3］。还有一些研究表明糖尿病可导致大鼠睾丸质量明显降低和精子生成异常，一些糖尿病动物模型发生下丘脑-垂体-性腺轴功能损伤和促性腺激素释放激素（gonadotropin-releasing hormone，GnRH）释放减少［4］。还有研究称糖尿病患者黄体生成素（luteinizing hormone，LH）和卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，FSH）对GnRH的反应不敏感［5］。许多糖尿病动物性腺功能减退都与氧化应激损伤、线粒体活性氧（Reactive oxygen species，ROS）生成增加有关［6］。因此，抗氧化剂可被用于治疗氧化应激损伤引起的内分泌失衡和不孕不育。萜类化合物是指具有异戊二烯（C5H8）n通式以及其含氧和饱和程度不同的衍生物，可以看成是由异戊二烯或异戊烷以各种方式连结而成的一类天然化合物，在自然界中广泛存在。环烯醚萜是萜类化合物中最常见的一类，具有广泛的生物学活性。研究表明，环烯醚萜对人体多系统存在抗氧化、类似抗低温、抗疲劳、耐缺氧及促进皮质激素样作用，可以改善体内自由基代谢和组织环境，修复细胞损伤，增加抗氧化剂的活性酶超氧化物歧化酶和过氧化氢酶等，对糖尿病的多种并发症具有治疗作用［7］。本实验通过检测烟酰胺（nicotinamide，NA）和链脲霉素（streptozotocin，STZ）诱导的T2DM小鼠血清LH、FSH、睾酮（T）和精子参数变化，以期从抗氧化损伤角度深入探讨糖尿病小鼠不育的可能机制。

1　对象与方法

1.1研究对象56只7～8周龄SPF级健康雄性C57BL小鼠，购自天津医科大学动物实验中心。实验期间小鼠自由取食，于（20±4）℃、12 h/12 h的光/暗周期饲养，每周测量体质量。喂养1周后，按65 mg/kg给予造模组小鼠腹腔注射STZ（枸橼酸溶解作缓冲，pH4.5，Sigma-Aldrich公司，美国），15 min后注射NA 120 mg/kg（生理盐水溶解，Sigma-Aldrich公司，美国），连续5 d，对照组小鼠给予腹腔注射等体积的柠檬酸钠缓冲液。小鼠空腹血糖水平超过13.89 mmol/L被认为是糖尿病造模成功，血清葡萄糖水平较低者被剔除实验。

1.2研究方法小鼠随机数字表法均分为7组（n=8）：对照组，糖尿病组，糖尿病小鼠服用格列本脲0.25 mg/kg组（糖尿病+格列本脲组），糖尿病小鼠服用环烯醚萜（分别为20和40 mg/kg）组（糖尿病+环烯醚萜20 mg/kg组、糖尿病+环烯醚萜40 mg/kg组），正常小鼠服用环烯醚萜（分别为20和40 mg/kg）组（环烯醚萜20 mg/kg组、环烯醚萜40 mg/kg组）。格列本脲和环烯醚萜连续口服28 d［8］。最后1次治疗24 h后，水合氯醛麻醉脱颈处死小鼠。心脏穿刺收集血液样本，3 500 r/min离心20 min后，保存于-80℃。移除小鼠睾丸和附睾尾，称取睾丸质量，并按以下公式计算睾丸体积=长×宽× 高×0.52［8］。

1.3精子浓度及存活率评估将小鼠附睾尾分离并转移到1.5 mL生理盐水的培养皿中，剪碎后挤压组织使精子游离至培养液。待充分游离后，用精子计数板检测精子浓度，并进行精子活力分级（3级：原地不动、非前向运动和前向运动）检测，在400倍光学显微镜下测定精子存活率。

1.4放射免疫法检测血清激素水平应用德国Siemens公司ADVIA Centaur化学发光分析仪同批测定血清FSH、LH 和T水平。

1.5统计学方法采用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析，正态分布的计量资料以±s表示，多样本均数比较采用ANOVA分析，组间多重比较采用SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1环烯醚萜对小鼠体质量、睾丸质量和体积的影响糖尿病组小鼠体质量低于对照组，环烯醚萜40 mg/kg和格列本脲治疗可以恢复糖尿病引起的小鼠体质量减少（P＜0.05）。糖尿病组中睾丸质量明显减少，应用环烯醚萜（20和40 mg/kg）和格列本脲后，睾丸质量均比糖尿病组增加（P＜0.05），各组睾丸体积差异无统计学意义，见表1。

2.2环烯醚萜对小鼠精子参数的影响糖尿病组小鼠附睾的精子浓度和存活率显著低于对照组，糖尿病+环烯醚萜40 mg/kg组的精子数量和活力显著高于糖尿病组，糖尿病+格列本脲组比糖尿病组的小鼠精子浓度增高（均P＜0.05），见表2。

2.3环烯醚萜对小鼠精子LH、FSH、T水平的影响糖尿病组小鼠与对照组相比血清LH、FSH、T水平显著降低，环烯醚萜40 mg/kg和格列本脲可提升糖尿病小鼠的血清LH、FSH、T水平（均P＜0.05），见表2。

Tab.1　Comparison of body weights and testis weights and volumes between seven groups表1　各组小鼠体质量、睾丸质量和体积比较　　（n=8，±s）

Tab.1　Comparison of body weights and testis weights and volumes between seven groups表1　各组小鼠体质量、睾丸质量和体积比较　　（n=8，±s）

＊P＜0.05；a与对照组比较，b与糖尿病组比较，P<0.05

组别对照组糖尿病组糖尿病+格列本脲组糖尿病+环烯醚萜20 mg/kg组糖尿病+环烯醚萜40 mg/kg组环烯醚萜20 mg/kg组环烯醚萜40 mg/kg组F实验前体质量（g）34.84±0.78 34.59±1.33 33.63±1.09 34.28±1.05 33.87±0.89 34.43±1.14 34.62±1.45 0.896实验后体质量（g）39.59±2.45 28.23±0.78a32.34±1.89b30.22±2.01 37.44±1.14b38.39±2.44 38.69±2.65 19.246＊睾丸质量（mg）91.89±4.07 67.21±4.12a81.27±5.20b87.55±5.44b94.47±5.13b101.45±9.23 96.12±4.65 51.542＊睾丸体积（mm3）3.95±0.84 2.88±0.69 3.90±0.73 2.73±0.68 2.79±0.51 3.92±0.78 4.15±0.95 2.466

Tab.2　Effects of iridoid on LH，FSH and T levels and sperm parameters in different groups表2　环烯醚萜对小鼠精子浓度和存活率及精子LH、FSH、T水平的影响　　（n=8，±s）

Tab.2　Effects of iridoid on LH，FSH and T levels and sperm parameters in different groups表2　环烯醚萜对小鼠精子浓度和存活率及精子LH、FSH、T水平的影响　　（n=8，±s）

＊P＜0.05；a与对照组比较，b与糖尿病组比较，P<0.05

组别对照组糖尿病组糖尿病+格列本脲组糖尿病+环烯醚萜20 mg/kg组糖尿病+环烯醚萜40 mg/kg组环烯醚萜20 mg/kg组环烯醚萜40 mg/kg组F精子浓度（×106/mL）1.98±0.20 1.51±0.16a1.99±0.19b1.66±0.16 2.04±0.16b2.02±0.21 2.14±0.20 54.658＊精子存活率（%）68.34±7.34 44.15±5.57a52.56±6.86 52.63±8.89 64.67±4.24b62.63±6.47 67.28±7.36 49.753＊组别对照组糖尿病组糖尿病+格列本脲组糖尿病+环烯醚萜20 mg/kg组糖尿病+环烯醚萜40 mg/kg组环烯醚萜20 mg/kg组环烯醚萜40 mg/kg组F LH（IU/L）26.89±1.68 19.37±1.41a24.16±1.40b22.11±1.35 26.33±1.11b28.56±2.31 28.01±2.09 15.646＊FSH（IU/L）4.67±0.33 3.78±0.18a4.47±0.32b4.27±0.36 4.73±0.28b5.11±0.63 5.22±0.44 25.179＊T（nmol/L）6.61±0.41 4.38±0.34a6.56±0.46b5.28±0.56 6.22±0.52b6.83±0.52 6.98±0.47 22.256＊

3　讨论

本研究表明，NA-STZ所致糖尿病可引起小鼠体质量和睾丸质量减少，这与许多之前的报道是一致的［9］。这可能是由于糖尿病引起的碳水化合物、脂类和蛋白质代谢紊乱所致［10］。本研究进一步研究表明，加用40 mg/kg环烯醚萜可以改善糖尿病小鼠下降的体质量和睾丸质量。既往的研究表明糖尿病可以导致啮齿类动物精子数量和活力降低［11］。本研究中糖尿病组小鼠精子浓度和精子存活率较对照组明显降低。同时注射NA和STZ可以诱导小鼠T2DM的发病，NA可以保护STZ导致的胰岛细胞损害。氧化应激损伤在糖尿病引起的男性生殖功能障碍中发挥着关键作用。还有一些研究表明，STZ具有杀精作用并可引起精子发生异常，过量生成的ROS是其重要机制之一［10］。精子膜含大量多不饱和脂肪酸，对氧化应激高度敏感。此外，ROS，尤其是过氧化氢，可能跨膜扩散进入细胞并抑制一些抗氧化剂酶活性，这可能会反过来导致ATP减少、睾丸氧化损伤、生殖细胞凋亡、精子数量和活力下降。诸多研究证实抗氧化剂治疗对精子活性的保护作用［4，8，11］。一些报道称，环烯醚萜具有改善骨代谢的作用，通过加强骨髓成骨细胞抗氧化酶活性可促进骨形成和骨修复［12］；环烯醚萜能增加大鼠肝、脑组织中过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶及肝组织中的超氧化物歧化酶活力，改善大鼠大脑细胞膜脂质过氧化损伤和脑细胞凋亡［13］；环烯醚萜还可使丙二醛（malondialdehyde，MDA）和过氧化脂含量降低，对帕金森患者脑细胞起到保护作用［14］。因此，在本研究结果的基础上笔者认为，环烯醚萜可以通过改善ROS生成和抗氧化防御，从而增加精子浓度并改善精子活力。

本研究还发现糖尿病小鼠的血清LH、FSH和T水平较对照组降低，与之前的报道一致［15］。众所周知，FSH和LH对睾丸生精功能至关重要，FSH是评估支持细胞功能的重要指标，FSH的减少会导致支持细胞功能障碍，导致精子生成减少；LH促进睾丸间质细胞产生T，糖尿病导致的睾丸间质细胞的数量和功能的降低会降低血清T水平。血糖和胰岛素的代谢变化也与LH和FSH的生成有关，胰岛素对睾丸间质细胞发挥正常功能和T的生产发挥积极作用。胰岛素水平降低会显著影响睾丸间质细胞的数量和功能以及血清T水平。本研究发现环烯醚萜40 mg/kg治疗恢复了糖尿病小鼠下降的血清LH、FSH和T水平，提示环烯醚萜改进精子参数可能是通过提高血清促性腺激素和T的水平来发挥作用的。多种用于治疗男性少弱精子症的中药或其提取物中均含有环烯醚萜类化合物，且该化合物可能是治疗男性少弱精子症的重要化学基础之一［16］；Jiang等［17］将含有环烯醚萜的中药制剂喂服小鼠，观察其体内、体外受精结局，发现环烯醚萜可以显著提高小鼠精子顶体酶含量并且增加受精率；还有研究认为环烯醚萜可呈剂量依赖性地促进体外培养小鼠支持细胞的增殖，抑制细胞凋亡，也可能通过促进支持细胞的增殖与活性促进精子发生，改善和修复睾丸、附睾及精子的超微结构的病理性损伤，从而保护生精功能，改善精子活力等［18］。

格列本脲属于磺酰脲类抗糖尿病的药物，可促进T2DM胰岛分泌胰岛素。这种药物可以通过提高抗氧化酶活性、增加抗氧化防御、增加血清促性腺激素水平、T水平和糖尿病动物的精子生成［19］。本研究结果与先前的研究结果一致，提示格列本脲可通过其抗氧化性能改善糖尿病小鼠的生精功能障碍。

综上，环烯醚萜通过增加血清LH、FSH、T水平来改善T2DM引起的生殖功能障碍，使精子浓度、活力升高。

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（2016-04-08收稿2016-04-26修回）

（本文编辑闫娟）

中图分类号：R587.1，R588

文献标志码：A

DOI：10.11958/20160275

Effects of iridoid on spermatogenesis of nicotinamide-streptozotocin induced type-2 diabetic mice

CHEN Tong
Department of Urology,Tianjin Hospital,Tianjin 300211,China

Abstract：ObjectiveTo investigate the effects of iridoid on the spermatogenesis in mice of type-2 diabetes induced by nicotinamide and streptozotocin.MethodsFifty-six male C57BL mice were randomly divided into seven groups(n=8 for each group):control group,diabetic group,diabetic and glibenclamide(0.25 mg/kg)group,diabetic and iridoid(20 and 40 mg/kg)group,and iridoid(20 and 40 mg/kg)group.Diabetic model was induced by intraperitoneal injection of streptozotocin(65 mg/kg)and nicotinamide(120 mg/kg).Glibenclamide and iridoid were orally fed for 28 days.Twenty-four hours after the last treatment,blood samples,testis and the epididymis were collected for detecting blood hormones, testicular biopsy,and the evaluation of sperm parameters.ResultsThe body weights of diabetic mice were recovered from the reduction after treatment with 40 mg/kg of iridoid and glibenclamide（P＜0.05).The sperm count and viability were significantly decreased in diabetic group compared with those of control group(P＜0.05).The sperm count was significantly increased in diabetic and glibenclamide group than that of diabetic group(P＜0.05).The serum levels of lutein hormone (LH),follicle stimulating hormone(FSH)and testosterone(T)were significantly decreased in diabetic group compared with those of control group(P＜0.05).The serum levels of LH,FSH and T were increased after treatment with 40 mg/kg of iridoid and glibenclamide(P＜0.05).ConclusionThese results suggest that iridoid can reduce the level of oxidative damage indiabetic mice,and effectively improve the fertility of mice.

作者单位：天津市天津医院泌尿外科（邮编300211）

作者简介：陈彤（1969），男，副主任医师，主要从事泌尿外科疾病的诊断及治疗

Key words:diabetes mellitus，type 2；iridoides；luteinizing hormone；follicle stimulating hormone；testosterone；spermatozoa；mice,inbred C57BL；antioxidant