白花丹素对骨肉瘤MG-63细胞迁移的影响及其作用机制

田林强　刘晓潭　郭志豪　王宏伟　张天吉

白花丹素对骨肉瘤MG-63细胞迁移的影响及其作用机制

田林强刘晓潭郭志豪王宏伟张天吉

【摘要】目的 观察白花丹素对骨肉瘤细胞迁移的抑制作用并初步探讨其可能的机制。方法 以2.5 μmol/L、5 μmol/L 和10 μmol/L浓度白花丹素分别作用于骨肉瘤MG-63细胞，以含0.1%DMSO完全培养基为对照组。作用24 h后，Transwell法观察骨肉瘤MG-63细胞迁移能力，Real-time PCR检测骨肉瘤MG-63细胞中Ezrin基因mRNA表达情况，Western blot检测Ezrin蛋白和p-Ezrin的表达情况。结果 Transwell结果显示，作用24 h后，各实验组下层小室细胞数明显减少，2.5 μmol/L组、5 μmol/L组和10 μmol/L组的细胞迁移率分别为（69.9±4.5）%、（39.3±3.5）%和（26.2±4.1）%，呈浓度依赖性（P＜0.05）；Real-time PCR结果显示，骨肉瘤MG-63细胞中Ezrin mRNA表达水平明显下降，呈浓度依赖性（P＜0.05）。Western blot结果显示，Ezrin蛋白和p-Ezrin的表达量明显降低，呈浓度依赖性（P＜0.05）。结论 白花丹素能够抑制骨肉瘤MG-63细胞迁移，其作用机制可能与抑制骨肉瘤MG-63细胞中Ezrin的表达及活化有关。

【关键词】骨肿瘤；骨肉瘤；白花丹素；Ezrin基因；MG-63细胞；迁移

骨肉瘤多发于青少年和老年人群，转移是治疗失败和死亡的主要原因之一。初诊时15%～20%的患者已发生远处转移，治疗期间40%～60%的患者可发生转移，其中绝大部分为肺部转移［1］。Ezrin蛋白是细胞骨架蛋白家族成员，在细胞变形和运动中发挥重要作用。本组前期实验研究发现，白花丹素可诱导骨肉瘤细胞凋亡，可能通过p53途径和产生细胞内活性氧实现，但对骨肉瘤细胞转移的影响并不十分清楚［2］。为

1　材料与方法

1.1材料和仪器

白花丹素（plumbagin）、DMSO购自美国Sigma公司。将白花丹素溶于DMSO溶液中，配成0.1 mol/L储存液存放于-20℃冰箱备用。胎牛血清和RPMI 1640细胞培养基购自Hyclone公司，青-链霉素双抗、考马斯亮蓝、凝胶试剂盒、硝酸纤维素膜、ECL发光试剂盒、兔抗人一抗和羊抗兔二抗购自武汉博士德生物工程有限公司，倒置相差显微镜及荧光显微镜购自日本Nikon公司，细胞培养箱（Heal Force HF240）。

1.2细胞培养

骨肉瘤细胞系MG-63购自中国科学院细胞库（上海）。用含10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素和0.1 mg/mL链霉素的RPMI 1640培养基培养，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中。2～3 d全量换液1次。倒置相差显微镜观察细胞生长情况，铺满80%左右时，用0.25%胰酶（含0.02%EDTA）进行消化，按1∶3比例进行传代。于细胞对数生长期内进行实验。

1.3Transwell法检测细胞迁移能力

细胞传代后，制成约106/mL的细胞悬液（培养基不含胎牛血清），取200 μL接种于上层小室内，实验组分别加入相应浓度的白花丹素，即2.5 μmol/L（2.5 μmol/L组）、5 μmol/L（5 μmol/L组）和10 μmol/L（10 μmol/L组），以含0.1%DMSO完全培养基为对照组。下层小室内加入300 μL含10%胎牛血清的培养基作为化学诱导物，每组设3个复孔。37℃培养24 h后，取出下层小室，吸干培养基，加入4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗涤3次，Gemisa溶液染色5 min，在高倍镜下（10×40）随机选取5个视野计数细胞，取平均数作为实验结果。以对照组细胞迁移率为100%，计算各实验组细胞的迁移率。

1.4Real-time PCR检测Ezrin基因mRNA的表达

取对数生长期细胞，不同浓度白花丹素干预24 h后，采用Trizol法提取细胞总RNA，按说明书进行操作。分光光度计测定RNA浓度后，取1 μg RNA逆转录为cDNA，操作过程按逆转录试剂盒说明书进行。引物序列：Ezrin上游引物为5′-CTCTGACTCCAGGTTGGGAC-3′，下游引物为5′-GGCCGATAGTCTTTACCACCT-3′；β-actin上游引物为 5′-CCACCATGTACCCTGGCATT-3′，下游引物为5′-ACTCCTGCTTGCTGATCCAC-3′。采用25 μL反应体系，按说明书进行。PCR反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性10 s，60℃退火延伸30 s，共40个循环。采用2-ΔΔCt法计算相对表达量。对照组Ezrin基因mRNA转录水平设为1。

1.5蛋白提取和Western blot检测Ezrin蛋白及p-Ezrin的表达水平

取对数生长期细胞，以106/mL密度种植于六孔板培养过夜。不同浓度白花丹素作用骨肉瘤MG-63细胞24 h后，4℃PBS漂洗3次；0.25%胰酶消化并收集细胞（漂洗液离心后收集细胞），加入200 μL RIPA裂解液（含体积分数为1%的PMSF）置于冰上裂解30 min。4℃、12 000 r/min离心15 min（低温离心机提前30 min启动并预冷），收集上清液，考马斯亮蓝法测蛋白浓度。用RIPA裂解液调整样品蛋白浓度至相同水平，热变性蛋白。取相同总量的蛋白质进行凝胶电泳，转膜，孵育一抗（1∶1 000稀释）4℃过夜。加入二抗（1∶2 000稀释），室温孵育2 h，TBST漂洗3次，每次10 min。在暗室内使用ECL发光液发光，压片后曝光盒曝光。图片照相后用Qantity One分析软件进行分析测定。

1.6统计学处理

采用SPSS 15.0统计软件对数据进行分析。数据以均数±标准差（x±s）表示，组间均数比较采用ANOVA方差分析，计数资料比较采用Χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　　结果

2.1白花丹素对骨肉瘤MG-63细胞迁移能力的影响

Transwell实验结果显示，不同浓度白花丹素作用骨肉瘤MG-63细胞24 h后，各实验组下层小室细胞数明显减少，2.5 μmol/L组、5 μmol/L组和10 μmol/L组的细胞迁移率分别为（69.9±4.5）%、（39.3±3.5）%和（26.2±4.1）%，与对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）；且随着白花丹素作用浓度增加，其对细胞迁移的抑制作用明显增强，呈浓度依赖性（P＜0.05），说明白花丹素能够抑制骨肉瘤MG-63细胞迁移。见图1。

2.2白花丹素对骨肉瘤MG-63细胞Ezrin mRNA表达的影响

Real-time PCR检测结果显示，不同浓度白花丹素作用骨肉瘤MG-63细胞24 h后，各实验组Ezrin mRNA表达水平明显下降，与对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.05），且随药物浓度增加其表达水平下降越明显，呈浓度依赖性（P＜0.05）。见图2。

图1　不同浓度白花丹素作用24 h后对骨肉瘤MG-63细胞迁移率的影响

图2　　不同浓度白花丹素作用24 h后对Ezrin mRNA表达的影响

2.3白花丹素对骨肉瘤MG-63细胞Ezrin蛋白及p-Ezrin表达的影响

Western blot结果显示，不同浓度白花丹素作用骨肉瘤MG-63细胞24 h后，Ezrin蛋白及p-Ezrin的表达水平均明显下降，且随药物浓度增加其表达水平下降越明显，呈浓度依赖性（P＜0.05），灰度分析结果显示，各组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见图3。

图3　　不同浓度白花丹素作用24 h后对Ezrin蛋白及p-Ezrin表达的影响

3　　讨论

白花丹素是从植物药白花丹的根茎中提取的醌类化合物，在抗炎、抗细菌及真菌中均可发挥重要作用［3，4］，其抗肿瘤作用及其机制亦是近年研究的热点之一。有报道在急性T淋巴细胞白血病中，白花丹素可抑制NF-κB信号通路，激活MAPK信号通路，通过半胱胺酸天冬氨酸蛋白酶通路诱导T淋巴细胞凋亡，同时对正常外周血单核细胞无明显细胞毒性［5］。Eldhose等［6］报道白花丹素能够阻滞结肠癌HCT116细胞于G1期，并通过线粒体途径和增加细胞内活性氧诱导细胞调亡，同时对贴壁细胞可明显地抑制细胞周期阻滞，而对循环细胞则更多的是诱导死亡，但对正常结肠细胞无明显毒副作用。而在神经系统肿瘤［7］、乳腺癌［8］、前列腺癌［9］等肿瘤实验中，白花丹素均能抑制细胞生长，促进细胞凋亡。在骨肉瘤细胞中，本课题组前期研究发现，白花丹素能够抑制骨肉瘤细胞增殖，可能通过调节p53/MDM2的表达及活性氧的产生实现［2］。但目前对白花丹素治疗骨肉瘤的研究主要集中在对肿瘤细胞的促凋亡作用，而对肿瘤细胞迁移作用的研究较少。为此，本研究以不同浓度白花丹素作用于骨肉瘤MG-63细胞24 h后，经Transwell实验证实白花丹素能够抑制骨肉瘤MG-63细胞迁移，且随着药物浓度增加其抑制作用越明显。

转移和浸润是骨肉瘤患者最主要的死亡原因，但发生转移机制目前尚不清楚。肿瘤转移是一个非常复杂的过程，包括肿瘤细胞解离进入血液循环、在循环中躲避免疫细胞的杀伤、离开血液循环在远处建立新的转移灶等过程［10］。在这些过程中，肿瘤细胞的形态变化发挥重要作用。Ezrin蛋白是膜细胞骨架连接蛋白，参与微绒毛的形成，对细胞运动、黏附、细胞骨架重塑等过程发挥重要作用。在多种肿瘤中，Ezrin蛋白均高表达，且与患者预后相关［11］。在子宫颈癌中，Ezrin蛋白表达明显增高，主要分布在细胞质和细胞膜中，而正常细胞中Ezrin仅在细胞膜中表达，且与肿瘤细胞MMP-2、MMP-9和HPV E6蛋白表达呈正相关，说明Ezrin蛋白与肿瘤转移可能有关［12］。在一项57例原发性骨肉瘤的临床研究中发现，82.5%的骨肉瘤标本中高表达Ezrin蛋白，且与患者的年龄（年龄越小越倾向于高表达）、低分化和生存期缩短呈正相关，说明Ezrin可作为判断骨肉瘤预后的指标［13］。Ezrin蛋白能够促进骨肉瘤细胞在转移灶处存活，且能通过调节mRNA的表达和与多聚A结合蛋白结合，从而调节骨肉瘤细胞转移的效率［14］。在一项256例儿童骨肉瘤和横纹肌肉瘤的临床研究中发现，Ezrin蛋白的表达与肿瘤局部复发和转移有相关性［15］。此外，Ezrin蛋白可与糖蛋白结合，从而促使骨肉瘤多重耐药的发生，而抑制Ezrin蛋白的表达，可使骨肉瘤耐药细胞株对抗肿瘤药物再次敏感［16］。Khanna等［17］的研究证实，Ezrin C末端567位点苏氨酸的磷酸化是Ezrin活化的主要形式，将567位点的苏氨酸用丙氨酸替换后，能够明显抑制骨肉瘤细胞转移。综上认为，抑制Ezrin蛋白的表达及其活性，可能是治疗骨肉瘤转移的新途径。本研究通过Real-time PCR和Western blot实验发现，不同浓度白花丹素作用于骨肉瘤MG-63细胞24 h后，Ezrin基因的转录和翻译受到明显抑制，同时能够调节p-Ezrin表达水平，且随着药物浓度的增加抑制作用明显增强，说明白花丹素不仅可抑制Ezrin蛋白的表达，同时可抑制Ezrin蛋白的活化，从而抑制其功能。因此推测白花丹素可能通过下调Ezrin表达并降低其磷酸化水平，从而抑制骨肉瘤MG-63细胞的迁移。

综上所述，本研究结果证实白花丹素可在体外抑制骨肉瘤MG-63细胞迁移，其作用机制可能是通过调节Ezrin表达及其活化，提示Ezrin蛋白可能是骨肉瘤治疗的潜在靶点。但本研究未对Ezrin信号通路进行研究，白花丹素通过何种信号通路调节Ezrin蛋白的表达尚未清楚，有关方面有待进一步深入研究。

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［2016-04-25收稿］［2016-05-26修回］［编辑罗惠予］

作者单位：453003新乡河南新乡医学院第三附属医院骨二科

【中图分类号】R738.1

【文献标志码】A

【文章编号】1674-5671（2016）03-04

DOI：10.3969/j.issn.1674-5671.2016.03.01

【基金项目】新乡医学院科学研究培育基金资助项目（2014QN104）此本研究以不同浓度白花丹素作用骨肉瘤MG-63细胞，观察其对细胞迁移的抑制作用，并探讨可能的作用机制，以期为白花丹素用于临床治疗骨肉瘤提供实验依据。

Effects of plumbagin on invasion in osteosarcoma cell line MG-63 and its possible mechanisms

Tian Linqiang，Liu Xiaotan，Guo Zhihao，Wang Hongwei，Zhang Tianji（Department of Orthopedic Surgery，No.3 Affiliated Hospital，Xinxiang Medical University，Xinxiang 453003，P.R.China）

【Abstract】Objective To assess the ability of plumbagin to inhibit invasion by osteosarcoma and explore possible mechanisms. Methods Osteosarcoma MG-63 cultures were treated for 24 h with 0.1%DMSO only（control）or with plumbagin at 2.5，5 and 10 μmol/L.Then the invasive ability of the MG-63 cells was measured in a trans-well assay，changes in Ezrin mRNA levels were determined using real-time PCR，and changes in Ezrin and p-Ezrin protein levels were assessed using Western blot assay. Results Plumbagin treatment reduced the number of invading artificial basement cells in a dose-dependent manner，and rate of cell migration at the three plumbagin doses was respectively，69.9±4.5%，39.3±3.5%and 26.2±4.1%of control cells（P＜0.05）. Real-time PCR showed that plumbagin significantly reduced level of mRNA in a dose-dependent manner（P＜0.05）.Similarly，Western blotting showed that plumbagin significantly reduced levels of Ezrin and p-Ezrin in a dose-dependent manner.Conclusion Plumbagin may inhibit tissue invasion by osteosarcoma MG-63 cells，and it may do so in part by suppressing Ezin and p-Ezrin expression.

【Key words】Bone neoplam；Osteosarcoma；Plumbagin；Ezrin；MG-63 cells；Invasion