2015年宁夏小麦田禾谷孢囊线虫的分布

赵 鹏，李惠霞，李健荣，徐鹏刚，坚晋卓，彭德良

(1.甘肃农业大学草业学院/草业生态系统教育部重点实验室/中-美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃兰州 730070；2.中国农科院植物保护研究所/植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193)



2015年宁夏小麦田禾谷孢囊线虫的分布

赵 鹏1，李惠霞1，李健荣1，徐鹏刚1，坚晋卓1，彭德良2

(1.甘肃农业大学草业学院/草业生态系统教育部重点实验室/中-美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃兰州 730070；2.中国农科院植物保护研究所/植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193)

摘要：为明确宁夏地区小麦田孢囊线虫分布情况及线虫种类，2015年8月，采用z字形取样法对宁夏5个地级市的14个县(市/区)小麦孢囊线虫的分布与发生情况进行了调查。结果发现，206份小麦根际土壤样本中，有98份检测出了孢囊，检出率为47.6%。被调查的14个县(市/区)小麦田均有禾谷孢囊线虫分布，其中固原市各县/区禾谷孢囊线虫的发生是首次报道。贺兰县的孢囊线虫检出率最高，达88.9%，彭阳县的检出率最低，为11.1%；14个县(市/区)依据孢囊线虫检出率的大小顺序为：贺兰县>原州区>西吉县>中宁县>永宁县>青铜峡市>平罗县>同心县>泾源县>利通区>惠农区>隆德县>海原县>彭阳县。其中贺兰县、青铜峡市、同心县发生最严重，每100 mL土样孢囊数在 20个以上的样品分别为5.6%、8.3%和11.1%。对所分离的主要线虫群体进行形态学显微观察和测量，并对其rDNA-ITS序列进行测定和聚类分析。结果表明，来自宁夏地区的小麦田孢囊线虫主要群体均为燕麦孢囊线虫(Heterodera avenae)。

关键词：禾谷孢囊线虫；宁夏；发生与分布；鉴定

禾谷孢囊线虫(cereal cyst nematode，CCN)是一种危害严重的全球性的禾谷类植物线虫病害。1874年，在德国东部最早被发现，之后遍及欧洲、亚洲、非洲、北美洲、南美洲和大洋洲等40多个国家[1]。1989年，陈品三等[2]首次在我国湖北天门发现CCN危害小麦，随后，在河南、河北、北京、内蒙古、青海、山东、山西、陕西、宁夏、甘肃、安徽、江苏、天津、西藏和新疆等15个省(市/自治区)相继被发现[3-9]。据调查，一般情况下，CCN发生可使植物减产20%～40%，严重时减产可达70%以上[10]。 黄文坤等[17]最早在宁夏发现CCN并对宁夏南部山区以北部分地区的线虫分布做了报道，发现CCN发生面积达3.6 hm2。宁夏处于西北内陆，是典型的中温带大陆型气候区，干旱山区年平均降水量为400 mm，引黄灌区的平均降水量为157 mm，全年平均气温5.3～9.9 ℃，温度和湿度条件都非常适合CCN的繁殖。从地域看，宁夏与发生CCN的甘肃省、陕西省和内蒙古自治区接壤，且甘肃省和青海省地处黄河上游，通过河流灌溉及收割机跨区收割小麦会加剧CCN的传播和蔓延，潜在为害逐年加重，一旦暴发，将对宁夏的小麦生产造成巨大损失。因此，本研究于2015年8月对宁夏全区小麦主要种植地区CCN的发生和分布进行了调查，并通过形态学和rDNA-ITS序列分析进行了类别鉴定，以明确宁夏小麦种植区CCN的分布现状，为小麦病虫害预防和高产栽培措施的制定提供参考依据。

1材料与方法

1.1采样点概况

宁夏位于中国西北部，北纬35°14′～39°23′,东经104°23′～107°23′，地势南高北低，地形南北狭长，平均海拔1 000 m以上。2015年8月份，在宁夏石嘴山市、银川市、中卫市、吴忠市、固原市五个地级市的14个县(市/区)采集小麦根际土壤。

1.2田间土样采集方法

采用z字形取样法，采集小麦根及根际的土壤。每块小麦地块采集20～30个点，将采集的小麦根系及土壤混合均匀后装在塑料袋中，形成1份混合样本。记录采集地的经纬度、海拔及所属村镇等信息，并对样本进行编号。相邻采样点间隔的距离一般为10～20 km。

1.3孢囊的分离和计数

将混合均匀的样本风干，从每个样本中取100 mL土样于塑料桶中，加水并不断搅动，使土块完全溶解，静置2 min以上，沉淀后将悬浮液依次倒入26目和60目的筛网过滤，重复3次至桶中无漂浮的残渣。用强水流冲洗26目筛网上的残余物，使孢囊全部冲入60目的筛网中；小水流轻轻淋洗60目筛网上的残余物于三角瓶中。将收集的悬浮液倒入装有滤纸的三角漏斗中过滤，待滤液流尽后，将带有孢囊的滤纸在解剖镜下检测孢囊数。每个样点随机挑取5个饱满孢囊，挤破后检测每个孢囊中的卵粒数。

1.4孢囊线虫形态学鉴定

每个样点随机挑取5个饱满孢囊，测量孢囊和卵的长宽；将二龄幼虫热杀死后制成临时玻片，测量并观察主要的形态特征。取部分饱满孢囊切取阴门锥，将切下的阴门锥在无水乙醇中脱水固定后用甘油明胶制片，在显微镜下直接观察并测量膜孔长宽和阴门裂长[13]。

1.5孢囊线虫的分子鉴定

孢囊线虫DNA的提取参照彭德良的方法[11]，-20 ℃贮藏备用。PCR扩增反应体系(25 μL)：模板DNA 2 μL,引物各1 μL，2×DNA star mix 13 μL，ddH2O补足到25 μL，引物为TW81(5′-GTTTCCGTAGGTGAACCTGC-3′)，AB28(5′-ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT-3′)[14]。扩增条件：94 ℃预变性4 min，94 ℃30 s，56.7 ℃30 s，72 ℃1 min，循环35次，72 ℃延伸10 min。1.5%的琼脂糖凝胶电泳，100 V，45 min；BIO-RAD成像仪观测、照相。将扩增产物送至上海生工进行测序；将所得序列用Chromas、DNAMAN分析比对，并在NCBI查找已知近缘种序列，用MEGA 6中的UPGMA法构建孢囊线虫群体的系统发育树，进行亲缘关系分析。

2结果与分析

2.1CCN在宁夏不同地区的分布状况

由表1可知，共采集到206份样本，检测出有孢囊的样本98份，检出率为47.6%。5个地级市中，孢囊检出率最高的是银川市，达73.3%，检出率最低的是中宁市，为37.5%，固原市为57.9%，吴忠市为44.83%，石嘴山市为41.4%。14个县(市/区)孢囊检出率由大到小依次为：贺兰县、原州区、西吉县、中宁县、永宁县、青铜峡市、平罗县、同心县、泾源县、利通区、惠农区、隆德县、海原县、彭阳县。贺兰县的孢囊检出率最高，达88.9%，彭阳县最低，为11.1%。其中固原市各县/区CCN的分布状况属首次报道。

表1　宁夏小麦CCN在不同地区的分布

2.2CCN在宁夏不同地区的发生程度

由表2可知，宁夏14个县(市/区)CCN均有发生，不同地区小麦田的CCN发生程度不同。每100 mL土壤中平均孢囊数为5.3个，有37.2%的样品孢囊数为1～10个，4.6%为11～20个，2.2%为21～30个。利通区、中宁县、海原县、原州区、泾源县、彭阳县等6个县(市/区)被测样品的孢囊数均小于10个·100 mL-1土壤。检出率最高的贺兰县，72.2%的样品孢囊数在1～10个·100 mL-1土壤；样品孢囊数为21～30个·100 mL-1土壤所占比例最大的是同心县，为11.1%；发病地块孢囊数为11～20个·100-1mL土壤所占比例最大是青铜峡市，为16.7%。所有样品的孢囊数均小于30个·100 mL-1土壤。

2.3CCN的形态鉴定结果

对所分离的CCN进行形态学研究，结果显示(图1)，孢囊柠檬形，颈部和阴门锥明显，呈浅褐色至深褐色。孢囊长600.5 μm(421.5～803.1 μm)；孢囊宽444.5 μm(303.9～555.1 μm)。阴门锥膜孔为双膜孔，无下桥，阴门裂清晰可见。形态测量值分别为：阴门膜孔长43.4 μm(35.3～49.4 μm)；膜孔宽19.1 μm(16～24.4 μm)；阴门裂长11.9 μm(9.3～15.2 μm)，且阴门锥下方有较多不规则的泡状突。二龄幼虫都为蠕虫形，唇区圆，与身体连接处缢缩明显，口针强壮，中食道球发达；尾部呈锥形，有较长的透明区，其相关形态测量值为：线虫体长536.1 μm(389.4～629.9 μm)；线虫体宽23 μm(19.7～27.3 μm)；体长/体宽23.4(17.5～29.4)；体长/尾长9.9(6.4～15.8)；口针长20.2 μm(17.1～24.8 μm)；尾长56.2 μm(27.2～76.8 μm)；透明尾长36.8 μm(16.5～53.4 μm)。卵长124.4 μm(100.5～145.1 μm)；卵宽46.2 μm(38.2～58.1 μm)；孢囊卵量200.3粒(123～293.8粒)。根据上述形态观测和测量值并参考陈品三[2]、Zafar[12]和王明祖等[13]对燕麦孢囊线虫形态描述和测量值，将宁夏小麦田分离的CCN初部鉴定为燕麦孢囊线虫(Heteroderaavenae)。

A:深褐色孢囊; B:卵; C:阴门双膜孔; D:泡状突; E:二龄幼虫; F:二龄幼虫的头部; G:二龄幼虫的尾部

A:Cyst; B:Eggs; C:Fenestra area; D:Ballae; E:Second-stage juvenile; F:Head of second-stage juvenile; G:Tail of second-stage juvenile

图1 宁夏小麦孢囊线虫部分群体的形态特征图

Fig.1Illustration of cereal cyst nematode of populations from Ningxai

图2　UPGMA法构建的宁夏小麦禾谷孢囊线虫及其近源种的rDNA-ITS序列系统发育树

2.4孢囊线虫rDNA-ITS序列分析

将PCR产物测序后，得知ITS片段长度均为1 045 bp。将所得序列与NBCI的ITS序列进行Blast比对，这些序列分别包括Avenae组(澳大利亚的H.australis，中国、法国、德国、印度、以色列的H.avenae，德国的H.mani)、Schachtii组(伊朗的H.glycines，比利时的H.schachtii)、Goettingiana组(德国的H.goettingiana，荷兰的H.cruciferae，意大利的H.carotae)和比利时的H.urticae。用MEGA6的UPGMA方法构建ITS区的系统发育树发现(图2)，所有序列聚为3个大的分支，其中本研究分离的14个燕麦孢囊线虫与上述Avenae组的7个群体聚为一个大的分支，H.glycines和H.schachtii聚为一分支，Goettingiana组三个群体和H.urticae为一分支。在Avenae组的分支中，本研究分离的CCN与中国的H.avenae聚为一个小的分支，而其他国家的H.avenae聚在另一个分支中。

3讨 论

小麦禾谷孢囊线虫病是全球小麦生产的重要病害，可通过农机具、农事操作、水流等进行近距离传播[15]，飓风与跨区联合收割机收割进行远距离传播[16]。在地域上，宁夏回族自治区与已发现CCN的甘肃省、陕西省和内蒙古自治区接壤，而甘肃省地处黄河上游，通过河流灌溉及收割机跨区收割小麦会加剧CCN在宁夏的传播和蔓延。本研究发现，黄河流经地区的CCN检出率和孢囊量高于黄河未流经的其他地区，如中卫市的中宁县和海原CCN检出率差异显著，这可能与黄河流经过中宁县有关。与黄文坤等[17]2011年对宁夏CCN分布与发生情况的调查结果相比，本研究中的CCN检出率有所下降，这是由于近几年宁夏大面积种植玉米，减少了小麦的种植面积，但孢囊量和平均卵量却明显增加，说明近几年宁夏CCN危害程度有所增加。宁夏麦田平均孢囊密度5.3个·100 mL-1土壤，平均孢囊含卵量约200.3粒，已经超过小麦正常生长允许的阈值。侯生英等[18]报道CCN密度每克土壤大于或等于10粒卵时造成小麦15.5%～55%的产量损失，并建议在线虫种群密度大于每克土10粒卵的地区加强防范。因此对宁夏地区CCN的防治工作需要有关单位足够重视。宁夏固原市CCN的分布属首次提出，与其他4个地区相比较检出率和孢囊量都较低，这可能与固原市小麦大多与马铃薯、玉米等作物轮作，且多为山区，不利于线虫的传播等因素有关。

陈品三[2]、Zafar[12]和王明祖等[13]对燕麦孢囊线虫形态的测量值与本研究的测量数据存在略微差异，而形态描述基本一致。形态测量值差异可能是由不同地域的生态环境所致，不同的寄主也可能对群体分化有一定的影响。用UPGMA法构建宁夏CCN及其近源种的rDNA-ITS序列系统发育树发现，本研究中的CCN与中国的H.avenae和澳大利亚的H.australis聚为一个小的分支，揭示了他们之间具有更近的亲缘关系。

小麦CCN的防治方法主要有农业防治、抗病品种、生物防治和化学防治等。重复使用单一的防治措施容易使病原产生抗性，因此应综合采用两种或两种以上的控制措施防治CCN。通过作物轮作结合其他实用保护性高效措施，不仅防治效果好，且环境风险低。

参考文献：

[1]Rivoal R,Nicol J M.Past research on the cereal cyst nematode complex and future needs [M]//Riley I T,Nicol J M,Dababat A A.Cereal Cyst Nematodes:Status,Research and Outlook ,Ankara,Turkey:CIMMYT Press,2009:3-10.

[2]陈品三,王明祖,彭德良.我国小麦禾谷孢囊线虫的发现鉴定与初报[J].中国农业科学,1991,24(5):89-91.

Chen P S ,Wang M Z,Peng D L.Firstly report and identification of wheat cereal cyst nematodes in China [J].AgriculturalSciencesofChina,1991,24(5):89-91.

[3]张东升,彭德良,齐淑华.华北平原北部禾谷孢囊线虫的孵化特点[J].植物病理学报,1996,26(2):158.

Zhang D S,Peng D L,Qi S H.Incubation characteristics of the cereal cyst nematode in the northern of the North Plain China [J].JournalofPlantPathology,1996,26(2):158.

[4]Nicol J,Rivoal R,Taylor S,etal.Global importance of cyst(Heteroderaspp.) and lesion nematode(Pratylenchusspp.) on cereal:distribution,yield loss,use of host resistance and integration of molecular tools [J].NematologyMonographsPerspectives,2003,2:12-19.

[5]Yan G P,Smile R W.DistinguishingHeteroderafilipjeviandH.avenaeusing polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism and cyst morphology [J].Physiopathology,2010,100(3):216-224.

[6]杨传广,吴慧平,檀根甲,等.安徽省小麦孢囊线虫田间分布及危害调查[J].植物保护,2008,34(2):107-110.

Yang C G,Wu H P,Tan G J,etal.Investigations on the distribution of and damages caused by cereal cyst nematode in Anhui [J].PlantProtection,2008,34(2):107-110.

[7]陈 新,周洪友,马 玺.内蒙古中西部地区小麦禾谷孢囊线虫的发生分布[J].植物保护,2009,35(5):114-117.

Chen X,Zhou H Y,Ma X.Distribution ofHeteroderaavenaein the middle and west regions of Inner Mongolia [J].PlantProtection,2009,35(5):114-117.

[8]彭德良,黄文坤,孙建华,等.我国天津发现小麦禾谷孢囊线虫[M].植物线虫学研究﹙第四卷),2012:162-163.

Peng D L,Huang W K,Sun J H,etal.First report of cereal cyst nematode(Heteroderaavenae) in Tianjin of China [M].Study of Plant Nematode(Vol 4),2012:164-165.

[9]李惠霞,柳永娥,魏 庄,等.新疆和西藏发现禾谷孢囊线虫的分布[M].中国线虫学研究(第四卷),2012,4:164-165.

Li H X,Liu Y E,Wei Z,etal.The Detection ofHeteroderaavenaeFrom the Cereal Field in Autonomous Regions of Tibet and Xianjiang [M].Nematode Study in China(Vol.4),2012:164-165.

[10]吕 岩.小麦胞囊线虫病对小麦产量的影响调查[J].河南农业,2009(11):20.

LÜ Y.Investigation the effects of wheat cyst nematode on wheat yield [J].HenanAgriculture,2009(11):20.

[11]彭德良,Subbotin S,Moens M.小麦禾谷孢囊线虫(Heteroderaavenae)的核糖体基因(rDNA)限制性片段长度多态性研究[J].植物病理学报，2003,33(4):323-329.

Peng D L,Subbotin S,Moens M.rDNA restriction fragment length polymorphism ofHeteroderaavenaein China [J].ActaPhytopatholgicaSinica,2003, 33(4):323-329.

[12]Zafar A,Handoo.Key and compendium to species of theHeteroderaavenaegroup(Nematoda:Heteroderidae) [J].JournalofNematology,2002,34(3):250-262.

[13]王明祖,彭德良,武学勤.小麦孢囊线虫病的研究病原鉴定[J].华中农业大学学报,1991,10(4):352-356.

Wang M Z,Peng D L,Wu X Q.Study identification of pathogen on the wheat cereal cyst nematode [J].JournalofHuazhongAgriculturalUniversity,1991,10(4):352-356.

[14]Joyce S A,Reid A,Driver F,etal.Application of polymerase chain reaction(PCR) methods to identification of entomopathogenic nematodes [C]∥Bumell A K M,Ehlers R U,Masson J P.Cost 812 Biotechnology:Genetics of Entomopathogenic Nematode-bacte-rium Complexes.Belgium:European Commissi,1994:178-187

[15]Meagher J W.World dissemination of the cereal cyst nematode and its potential as a pathogen of wheat [J].JournalofNema-tology,1977,9(1):8-15.

[16]刘 钢.农业部种植业管理司提醒:可传带小麦孢囊线虫[J].农药市场信息,2009(16):42.

Liu G.Remind of department of plant management of the ministry of agriculture:cross harvest can spread on the wheat cereal cyst nematode [J].PesticideMarketNews,2009(16):42.

[17]黄文坤,叶文兴,王高峰,等.宁夏地区禾谷孢囊线虫的发生与分布[J].华中农业大学学报,2011,30(1):74-77.

Huang W Q,Ye W X,Wang G F,etal.Occurrence and distribution ofHeteroderaavenaeWollenweber in Ningxia Hui Autonomous Region [J].JournalofHuazhongAgriculturalUniversity,2011,30(1):74-77.

[18]侯生英,王爱玲,张 贵,等.小麦禾谷孢囊线虫病危害损失研究[J].农学学报,2012,2(8):33-36.

Hou S Y,Wang A L,Zhang G,etal.Effect of cereal cyst nematode on agronomic characteristics and yield losses of wheat [J].JournalofAgricultural,2012,2(8):33-36.

收稿日期：2015-12-30修回日期：2016-01-26

基金项目：国家公益性行业(农业)科研专项(201503114)；国家自然科学基金项目(31460463)

通讯作者：李惠霞(E-mail:lihx@gsau.edu.cn)

中图分类号：S512.1；S432.4

文献标识码：A

文章编号：1009-1041(2016)06-0808-06

Distribution of Cereal Cyst Nematode in Wheat Field of Ningxia Region in 2015

ZHAO Peng,LI Huixia,LI Jianrong,XU Penggang,JIAN Jinzhuo,PENG Deliang

(1.College of Pratacultural Science,Gansu Agricultural University/Key Laboratory of Grassland Ecosystem,Ministry of Education/Sino-U.S. Centers for Grazingland Ecosystem Sustainability,Lanzhou,Gansu 730070,China;2.State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pest/Institute of Plant Protection,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100193,China)

Abstract:In order to identify the new situations distribution of the cereal cyst nematode(CCN) and nematode species in Ningxia region,a survey of the occurrence and distribution of CCN was carried out in wheat fields using Z type sampling in 14 counties of five regions of Ningxia region in China in August of 2015. 206 samples of wheat roots and soils were collected and CCN were detected in 98 samples,with the incidence rate of 47.6%. The CCN was found in the 14 counties(city/district) and the distribution of CCN in Guyuan city is first reported. The highest CCN incidence rate of 88.9% was detected in Helan county and the lowest one of 11.1% was detected in Pengyang county. The descending order of incidence rate of CCN in 14 counties was ranged as Helen county>Yangzhou region>Xiji county>Zhongning county>Yongning county>Qingtongxia city>Pingluo county>Tongxin county>Jingyuan county>Litong region>Huinong region>Longde county>Haiyuan county>Pengyang county. The higher density of CCN were detected in Helan county,Qingtongxia city and Tongxin county and the average CCN numbers over 20 per 100 mL soils were 5.6%、8.3% and 11.1%,respectively. The morphology of the CCN was observed and measured under microscope. rDNA-ITS of CCN populations were sequenced and clustered. The results showed that the populations of CCN distributed in Ningxia are all Heterodera avenae.

Key words:Cereal cyst nematode; Ningxia; Occurrence and distribution; Identification

网络出版时间：2016-05-30

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20160530.1549.036.html

第一作者E-mail：1554602375@qq.com