莫诺苷对缺血再灌注大鼠皮层TIMP表达的影响

向本旭，孙芳玲，刘婷婷，艾厚喜，郭德玉，王宇峰，田　欣，祝自新，郑文荣，王　文

(首都医科大学宣武医院，北京　100053)



研究报告

莫诺苷对缺血再灌注大鼠皮层TIMP表达的影响

向本旭，孙芳玲，刘婷婷，艾厚喜，郭德玉，王宇峰，田欣，祝自新，郑文荣，王文

(首都医科大学宣武医院，北京100053)

【摘要】目的研究莫诺苷对缺血再灌注7 d大鼠皮层中金属基质蛋白酶组织抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinase, TIMP)表达的影响。方法25只雄性SD大鼠采用改良Zealonga线栓法制备大鼠大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型，术后随机分为模型组、莫诺苷小剂量组、中剂量组、大剂量组，每组5只。造模3 h后按30、90、270 mg/kg剂量每天一次灌胃莫诺苷。免疫印迹法(Western Blotting)和免疫荧光染色法(Immunofluorencent staining)分析莫诺苷对脑缺血再灌注7 d大鼠患侧皮层TIMP表达的影响。结果脑缺血再灌注7 d后，与假手术组相比，模型组TIMP蛋白表达显著升高(P<0.01)；同模型组相比，莫诺苷中剂量组(90 mg/kg)和大剂量组(270 mg/kg)TIMP蛋白表达均明显升高(P < 0.05；P < 0.01)。结论莫诺苷可以上调TIMP在大脑皮层内的表达，有助于脑卒中后血脑屏障的保护及修复。

【关键词】莫诺苷；脑缺血再灌注；TIMP；血脑屏障保护及修复

在全球范围内，脑卒中是继心脏病和癌症之后的第三大致死疾病；在我国，脑卒中是致死率最高的疾病，同时我国是脑卒中患者最多的国家。据统计我国拥有超过700万脑卒中患者，每年新增病例约150万，死亡率是欧美国家的3～4倍，约为日本的3倍[1]。脑卒中后，由于血氧不足首先引起缺血局部的炎症反应，自由基增多[2]，再灌注后引发血脑屏障通透性增加[3]，同时神经元大量死亡，胶质细胞和微血管受损，血脑屏障逐步被破坏，最终导致缺血灶局部组织完全坏死[4]。在脑卒中急性期调节血脑屏障通透性，阻止血脑屏障通透性进一步增加，保护血脑屏障完整性，从而保护神经血管单元的功能完整性，防止损伤的进一步增加，对脑卒中的治疗和康复有着重要作用。

TIMP是体内金属基质蛋白酶(metal matrix proteinases,MMPs)的自然抑制剂，两者在体内的相对含量决定了细胞基质的降解速度。MMPs是促进细胞外基质降解的主要蛋白酶，它们与血脑屏障的损伤密切相关。脑卒中发生后两者激活，直接参与到血脑屏障的降解，促使血脑屏障开放，引起屏障破坏、通透性增加及二次损伤等[5]。TIMP能有效抑制MMPs的激活，降低脑卒中后由MMPs引起的血脑屏障破坏，通透性增加及进一步损伤的发生，有助于脑卒中后血脑屏障的保护及修复，有助于神经功能康复[6]。

莫诺苷是本课题组从山茱萸中提取的单体化合物，我们的前期研究已经证明莫诺苷有抗氧化和抗凋亡的作用[7],动物实验证明莫诺苷能有效减小大脑梗死体积，有助于神经功能的恢复[8]。通过伊文思蓝染色证明莫诺苷有助于脑缺血再灌注大鼠血脑屏障的保护[9]，另外我们还发现莫诺苷能有效降低脑卒中大鼠梗死周边皮层中MMP-2和MMP-9的含量[10]。本研究中，我们对莫诺苷对脑卒中大鼠梗死周边皮层中TIMP表达进行研究，进一步探讨莫诺苷对血脑屏障的保护机制，为脑卒中治疗药物的研究提供依据。

1材料和方法

1.1实验动物分组及给药

8周龄雄性SD大鼠50只，体重260～280 g，由斯贝福(北京)实验动物科技有限公司提供【SCXK(京)2011-0004】，动物饲养于宣武医院实验SPF级动物室【SYXK(京)2010-2013】，预适应环境1周后进行实验，环境温度温度 24±2℃，湿度55±5%，术前12 h禁食不禁水。采用线栓法制备局灶性大鼠脑缺血再灌注模型后，随机分为假手术组、模型组、莫诺苷小(30 mg/kg)、中(90 mg/kg)、大(270 mg/kg)剂量组，共5组，每组10只。莫诺苷溶于蒸馏水，在MCAO造模3 h后，按照30、90、270 mg/kg剂量每天一次灌胃给药，连续给药7 d，假手术组和模型组给予等体积的蒸馏水。

1.2主要仪器和试剂

尼龙栓线，直径0.26 mm(2636-100)：北京沙东生物技术有限公司；尼康eclipse 80i正置荧光显微镜：日本Niko公司；高分辨率多模式分子成像系统：美国Carestream Health 公司；全波长酶标仪：美国 Thermo Fisher公司；超声波细胞破碎粉碎机：JY92-II 型，宁波市新芝科技研究所；电泳仪和小型垂直电泳槽：美国Biorad 公司。

TIMP抗体：美国Abcam公司；山羊抗兔Alex Flour594免疫荧光二抗；山羊血清原液; 含DAPI封片剂：北京中杉金桥公司；生理盐水；4%多聚甲醛灌注液；4%多聚甲醛后固定液；β-actin抗体：美国Santa Cruz公司。化合物莫诺苷，白色结晶，由宣武医院药物研究室自行从山茱萸中提取制备，高效液相色谱仪对组分进行分析(C18柱，柱温35℃，乙腈-水混合(15∶85)洗脱糖苷类，流速1.0 mL/min，检测波长240 nm)，莫诺苷的纯度为98.5%。

1.3MCAO模型制备及行为学评分

模型的制备参照Longa法[11]， SD雄性大鼠手术前禁食12 h。称重后将体重在260～280 g之间的大鼠用7%水合氯醛400 mg/kg进行腹腔注射麻醉。将麻醉后的大鼠用橡皮筋仰卧固定于手术操作台上，用安尔碘对颈部进行消毒。在大鼠颈部正中偏右约2～3 mm处纵向切口约1 cm后，对肌肉及筋膜进行钝性分离，注意避开甲状腺及大血管。当气管右侧及胸骨舌骨肌和胸锁乳突肌之间的三角区暴露后，继续钝性分离出右侧颈总动脉(common carotid artery，CCA)、颈内动脉(internal carotid artery，ICA)和颈外动脉(external carotid artery，ECA)。结扎ECA接近分叉处及 CCA近心端，用动脉夹夹闭ICA，在CCA用眼科剪剪一细小切口，将栓线小心插入，缓慢轻推栓线进入ICA，从ICA与ECA分叉处插入20 mm深度为宜，则能通过 ICA入颅进入了大脑中动脉(middle cerebral artery, MCA)，到达了大脑前动脉(anterior cerebral artery, ACA)起始部，阻断MCA的所有血供，造成了大脑中动脉阻塞，此时不再推入栓线，以免扎破血管造成蛛网膜下腔出血。将栓线与CCA一并结扎，松开动脉夹，记录栓塞开始时间。缝合肌肉，并在创口处涂少量青霉素，以预防伤口感染。栓塞30 min 后，用眼科镊向外极缓慢拔出栓线，实现再灌注。假手术组大鼠不插入栓线，其余操作与MCAO手术组相同。

MCAO手术以后注意保温，大鼠麻醉未醒之前应置于温控毯上，动物清醒后观察其行为。采用Longa 5分评分法进行术后行为学评分[12]：0分，正常，无神经功能缺损；1分，不能完全伸展对侧前爪；2分，行走时，向对侧(瘫痪侧)转大圈，中度神经功能缺损；3分，行走时，向对侧(瘫痪侧)转小圈；4分，行走时，向对侧(瘫痪侧)倾斜，重度神经功能缺损；5分，不能自发行走，有意识丧失。评分1～4分为造模成功，0分和5分淘汰。采用差额补充方法补足各组设计所需大鼠数量。以上动物实验操作均在首都医科大学宣武医院实验动物室进行，并按实验动物3R原则给予人道的关怀。

1.4 免疫荧光染色分析TIMP蛋白在半暗带表达

于造模后7 d将大鼠用10%水合氯醛400 mg/kg腹腔注射麻醉后，仰卧位固定于鼠板，迅速剪开大鼠胸腔。将灌注用钝型针头从心尖插入左心室至主动脉弓，迅速用止血钳夹住心脏与灌注针头，然后依次缓慢推入200 mL生理盐水与多聚甲醛灌注液，至大鼠四肢伸展僵硬。将灌注好的大鼠放置1 h后剥离大脑并放入后固定液中待用。

对于近年开展的“送培下乡”活动，我们通过座谈方式了解到：我们主动送课到乡，为学员节约了培训时间和培训成本，切实帮助他们取得了继续教育合格证书、普通话和电脑等级证书等，这一系列举措已获得学员好评。但我们通过问卷形式对送培活动参与者展开的调查发现，我们的培训活动中还存在一些比较突出的问题：1.农村学校教师工学矛盾冲突，学习积极性普遍不高。2.多学科混合的单一课程内容不能满足教师的培训需求。3.培训机构只管送的过程而不顾送的结果，教师的真实问题没有得到解决。4.教学设施和条件已不能满足教学基本要求。

将多聚甲醛固定好的大脑进行冰冻切片，切片厚度为20 μm，选取合适脑片进行免疫荧光染色。首先将脑片用10%山羊血清(0.1%PBS稀释)封闭1 h以去除非特异性抗原，然后用0.1%PBS洗液将脑片洗涤3次，每次10 min。吸出PBS洗液后，加入1∶200稀释的兔抗大鼠TIMP单克隆抗体于室温摇晃2 h后放于4℃冰箱内至少8 h。抗体孵育8 h后，再次用PBS洗液对脑片洗涤3次，每次10 min。再避光加入1∶200 PBS稀释的山羊抗兔Alex Flour594免疫荧光二抗，室温孵育2 h后再用PBS洗涤3次，每次10 min。洗涤完成后，将脑片贴于载玻片上，避光风干后滴加封片液加盖玻片封片。

将封好的脑片用尼康eclipse 80i正置荧光显微镜进行拍照，将拍好的图片用光盘拷出待分析，实验重复3次。

1.5Western-blot分析TIMP蛋白表达

于造模后7 d将大鼠用10%水合氯醛400 mg/kg 腹腔注射麻醉，迅速剥离大脑并将脑膜剥去，取出患侧皮层包入锡箔纸中，暂时放入液氮中冻存，后置于-80℃保存。取出患侧皮层于5 mL EP管中称重，加入预冷的裂解液7 μL/mg新鲜组织、PMSF1 μL/100 μL RIPA，冰浴粉碎机粉碎后超声粉碎。4℃静止30 min，4℃ 12000 r/min离心30 min，取上清液。采用BCA法定量蛋白浓度，并加入裂解液,调节各组总蛋白浓度一致。总蛋白加入5X上样缓冲液1∶4稀释，95℃变性10 min。

取大鼠患侧皮层脑组织裂解提取蛋白，进行SDS-PAGE电泳，每孔加入10 μL样品，先恒压60V电泳45 min；然后恒压90V电泳至分离胶底部，电转移到硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h，加入1∶1000稀释的兔抗大鼠TIMP单克隆抗体于室温摇晃2 h后放于4℃冰箱内至少10 h。TIMP抗体孵育10 h后，用TBST对膜洗涤3次，每次10 min，再加入1∶2000稀释的羊抗兔IgG-HRP，室温摇床孵育2 h，然后用TBST洗涤3次，ECL试剂显色、曝光并拍照，以β-actin作为内参，实验重复3次。

1.6统计学处理

2结果

2.1行为学评分

注：(A)大鼠在MCAO造模0 d和7 d各组神经功能评分结果：*P < 0.05, **P < 0.01与术后7 d模型组相比(n=10)；(B)免疫荧光检测梗死半暗带TIMP表达，a：假手术；b：模型组；c：莫诺苷小剂量组；d：莫诺苷中剂量组；e：莫诺苷大剂量组；(C)TIMP在半暗带阳性细胞数目统计结果：#P < 0.05与假手术相比；*P < 0.05,**P < 0.01与模型组相比(n=5)。图1　A：术后神经功能评分结果；B：TIMP免疫荧光染色结果(标尺=50 μm)；C：TIMP阳性细胞数目统计结果Note：(A)The modified neurological severity score (mNss) of rats on 0 day and 7 days after MCAO:*P < 0.05, **P < 0.01 compared with MCAO group on 7 days after operation (n=10);(B) The expression of TIMP in ischemic penumbra detected by immunofluorescent staining, a: sham group; b: MCAO group; c: morroniside low-dose group; d: morroniside middle-dose group; e: morroniside high-dose group;(C) The statistic result of the number of positive TIMP cells in penumbra: #P<0.05 compared with sham group; *P < 0.05 and **P < 0.01 compared with MCAO group (n=5).Fig.1　A: mNss score of rats on 0 day and 7 days after MCAO; B: Immunofluorescent staining of TIMP(Bar=50 μm); C: The statistic result of positive TIMP cells.

2.2TIMP免疫荧光染色结果

我们利用免疫荧光染色实验观察TIMP在缺血性脑卒中大鼠梗死周边表达。如图1(B)所示：大鼠缺血再灌注损伤7 d后，其梗死半暗带TIMP表达相对于假手术组有升高，说明缺血性脑损伤诱导了血脑屏障重构，缺血皮层中TIMP应激性升高以维持与MMPs的平衡；而莫诺苷给药后，大鼠缺血半暗带中TIMP表达相对于模型组也有增多，说明莫诺苷能促进半暗带中TIMP含量。对半暗带统计结果如图1(C)所示：术后7 d，模型组梗死半暗带中TIMP阳性细胞数目较假手术组有增多(P< 0.05)；莫诺苷给药后，小剂量组相对于模型组半暗带中TIMP阳性细胞数目增多(P< 0.05)；中剂量和大剂量则有显著增多(P< 0.01)。

2.3Western Blotting 对缺血皮层TIMP表达检测

Western Blotting对各组大鼠缺血侧皮层中TIMP表达量进行检测，检测结果如图2中A图所示。对各组大鼠缺血侧皮层中TIMP相对表达量进行统计，结果如图2中B图所示：模型组TIMP蛋白表达水平较假手术组有显著升高(P< 0.01)，这与免疫荧光染色的结果相一致；与模型组相比，中剂量组与大剂量较模型组有显著升高(P< 0.05;P< 0.01)，莫诺苷小剂量组表达水平与模型组相比有升高趋势，但无显著性差异。表明莫诺苷能有效促进缺血性脑损伤后TIMP升高，有利于血脑屏障的保护。

注：(A)各组大鼠缺血侧皮层TIMP表达水平；(B)各组大鼠缺血侧皮层TIMP相对表达定量结果。与假手术相比，##P < 0.01；与模型组相比，*P < 0.05，**P < 0.01。图2　TIMP在各组表达水平Note : (A) The expression level of TIMP in ischemic hemisphere of rats in all groups; (B) The relative expression quantitative level of TIMP in ischemic hemisphere of rats in all groups. Compared with sham group, ##P < 0.01; Compared with MCAO group, *P < 0.05 and **P < 0.01.Fig.2　TIMP expression level of TIMP in groups

3讨论

脑卒中发生后2 h内缺血灶可检测到MMPs表达增高[13]，我们前期研究发现大鼠脑缺血再灌注损伤后，其缺血侧皮层梗死周边区域MMP-2与MMP-9表达均上调[14]，这与大量研究证明的MMP-2在缺血再灌注早期引起血脑屏障开放[15]，MMP-9与血脑屏障二次开放引发损伤有关[16]相一致。TIMP作为MMPs的自然抑制剂，通过与MMPs结合从而降低MMPs在体内活性来发挥作用。在脑卒中发生后，TIMP能抑制MMPs的活性，在一定程度上阻止MMPs对基底膜的破坏和降解，从而保持血脑屏障的完整性。

本研究显示，莫诺苷能有效降低脑缺血再灌注7 d后神经功能损伤，有助于中风大鼠神经功能康复，通过免疫荧光和免疫印迹的方法确定了脑缺血再灌注损伤7 d后，大鼠缺血侧皮层TIMP表达量上调，这与已有报道一致[17]，可能与TIMP-MMPs平衡的自我调节有关。结果显示，莫诺苷能进一步诱导梗死侧皮层中TIMP增多，前期研究已经证明莫诺苷能降低大鼠脑缺血再灌注损伤7 d后梗死周边MMP-2和MMP-9表达，减小了血脑屏障的破坏[10]，结合两实验结果证明在莫诺苷能通过增高脑缺血再灌注后TIMP表达且降低MMPs表达量，从而有效降低MMPs诱导的血脑屏障破坏，有利于脑卒中的康复。

此外，临床针对脑卒中主要通过在治疗时间窗内进行r-tPA溶栓，时间窗外溶栓则有较高的再灌注损伤风险，现已有实验证明TIMP可降低时间窗外r-tPA溶栓造成的再灌注损伤[18]。 莫诺苷在脑缺血再灌注后能增加内源性MMPs自然抑制剂TIMP的表达，从而在避免了大脑在低氧、炎症等状态下由MMPs诱导的血脑屏障的破坏及其二次开放等损伤，这对脑卒中的治疗是有意义的。

参考文献：

[1]张皓. 脑卒中患者的康复治疗[J]. 中国全科医学：医生读者版，2010，4：59-60.

[2]Lei Huang, Sunnie Wong, Evan Y Snyder,etal. Human neural stem cells rapidly ameliorate symptomatic inflammation in early-stage ischemic-reperfusion cerebral injury [J]. Stem Cell Res Ther，2014; 5(6): 129.

[3]Adam J. Wells, Robert Vink, Stephen C,etal. Elevated Intracranial Pressure and Cerebral Edema following Permanent MCA Occlusion in an Ovine Model [J]. Plos One, 2015, 10(6): e013051.

[4]Birgit Obermeier, Richard Daneman, Richard M.,etal. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier [J].Nat Med, 2013, 19(12): 1584-1596.

[5]Tasaki A, Shimizu F, Sano Y,etal. Autocrine MMP-2/9 secretion increases the BBB permeability in neuromyelitis optica[J]. J Neurol Neurosurg Psychiatry, 2014, 85(4):419-430.

[6]Reuter B, Rodemer C, Grudzenski S,etal. Effect of simvastatin on MMPs and TIMPs in human brain endothelial cells and experimental stroke[J]. Transl Stroke Res, 2015, 6(2):156-159.

[7]孙芳玲，王文，安宜，等. 莫诺苷抑制过氧化氢诱导的SH-SY5Y神经细胞凋亡[J]. 中国康复理论与实践， 2009, 5:428-430.

[8]刘秀平， 许栋明， 王文，等. 莫诺苷对大鼠局灶性脑缺血再灌注模型脑梗死体积的影响[J]. 中国康复理论与实践， 2009,10:913-915.

[9]Sun FL, Wang W, Cheng H,etal. Morroniside improves microvascular functional integrity of the neurovascular unit after cerebral ischemia[J]. Plos One, 2014, 9(6):e101194.

[10]候虹丽， 孙芳玲， 艾厚喜， 等. 莫诺苷对脑缺血再灌注大鼠皮层梗死周边去基质金属蛋白酶表达的影响[J]. 中国康复理论与实践， 2015, 21(1):5-8.

[11]Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S,etal. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J]. Stroke, 1989, 20(1):84-91.

[12]Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S,etal. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J]. Stroke, 1989, 20(1):84-91.

[13]Nagel S, Su Y, Horstmann S,etal. Minocycline and hypothermia for reperfusion injury after focal cerebral ischemia in the rat: effects on BBB breakdown and MMP expression in the acute and subacute phase[J]. Brain Res, 2008, 1188:198-206.

[14]Suofu Y, Clark JF, Broderick JP,etal. Matrix metalloproteinase-2 or -9 deletions protect against hemorrhagic transformation during early stage of cerebral ischemia and reperfusion[J]. Neuroscience, 2012, 212:180-189.

[15]Xu H, Zhang Y, Sun H,etal. Effects of acupuncture at GV20 and ST36 on the expression of matrix metalloproteinase 2, aquaporin 4, and aquaporin 9 in rats subjected to cerebral ischemia/reperfusion injury[J].PLoS One, 2014, 9(5):e97488.[16]Cai H, Mu Z, Jiang Z,etal.Hypoxia-controlled matrix metalloproteinase-9 hyperexpression promotes behavioral recovery after ischemia[J]. Neurosci Bull, 2015, 31(5):550-560.[17]Pfefferkorn T, Rosenberg GA. Closure of the blood-brain barrier by matrix metalloproteinase inhibition reduces rtPA-mediated mortality in cerebral ischemia with delayed reperfusion[J]. Stroke, 2003, 34(8):2025-2030.

〔修回日期〕2015-12-25

[基金项目]“重大新药创制”科技重大专项(2012ZX09102201-106)；国家自然科学基金(81373994，81503049，81573633)。

[作者简介]向本旭(1990-)，男，硕士生，研究方向：神经药理。E-mail: xiangbenxu@126.com。 [通讯作者]王文(1968-)，男，博士生导师，研究方向：神经药理，中药药理。E-mail: lzwwang@163.com。

【中图分类号】R-332

【文献标识码】A

【文章编号】1671-7856(2016) 01-0001-06

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2016.001.001

Effects of morroniside on the expression of the TIMP in peri-infarct cortex after cerebral ischemia-reperfusion in rats

XIANG Ben-xu，SUN Fang-ling，LIU Ting-ting，AI Hou-xi，GUO De-yu, WANG Yu-feng， TIAN Xin, ZHU Zi-xin, ZHENG Wen-rong，WANG Wen

(Xuan Wu Hospital of Capital Medical University, Beijing 100053, China)

【Abstract】ObjectiveTo study the effects of morroniside on the expression of the tissue inhibitor of metalloproteinase (TIMP) of the ischemic ipsilateral cortex 7 days after ischemia reperfusion. Methods25 male Sprague-Dawley rats were subjected to middle cerebral artery occlusion (MCAO) model with modified Zea Longa’s method, and then divided them into sham group (n=5), ischmia group (n=5), and morroniside groups (low, medium, and high dosage groups, n=5) randomly. Morroniside were then administered intragastrically once a day at dose of 30 mg/kg, 90 mg/kg and 270 mg/kg 3 hours after operation. The expression of TIMP of the ischemic ipsilateral cortex on 7 days after ischemia-reperfusion were detected by western blotting and immunofluorescent staining analysis. ResultsCompared with the sham group, the expression of TIMP in ischemia group increased (P<0.05) 7 days after MCAO. Compared with the ischemia group, after treatment with morroniside at doses of 90 mg/kg and 270 mg/kg, the expression of TIMP increased significantly (P < 0.05; P<0.01). ConclusionsMorroniside could increase the expression of TIMP in the ischemic ipsilateral cortex and may contribute to blood-brain barrier protection and restoration.

【Key words】Morroniside; Cerebral ischemia-reperfusion; TIMP; Blood-brain barrier protection and restoration