检测特异抗体胶体金免疫层析试条诊断内脏利什曼病患者现场评价

冯晓平，高春花，石　锋，杨玥涛，汪俊云



检测特异抗体胶体金免疫层析试条诊断内脏利什曼病患者现场评价

冯晓平，高春花，石锋，杨玥涛，汪俊云

中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所，卫生部寄生虫病原与媒介生物学重点实验室，国家级热带病国际联合研究中心，世界卫生组织疟疾、血吸虫病和丝虫病合作中心，上海200025

摘要：目的在现场评价检测内脏利什曼病特异抗体的胶体金免疫层析试条诊断内脏利什曼病患者的效果。方法2013年采集动物源型内脏利什曼病流行区(四川省、甘肃省)和人源型内脏利什曼病流行区(新疆喀什市)疾病预防控制中心门诊就诊的病人血样和骨髓样本，用镜检法、内脏利什曼病试条和rK39试条进行平行测试，以镜检法为金标准，比较两种试条法检测的敏感性和特异性有无差异。结果内脏利什曼病试条和rK39试条检测镜检确诊的97例内脏利什曼病患者的敏感性分别为98.87%(96/97)，97.94%(95/97)，二者无统计学差异(χ2=0.34，P>0.05)。两种试条检测非内脏利什曼病病例145例， 均有2例假阳性反应，特异性为98.62(143/145)。对来自动物源型内脏利什曼病流行区和人源型内脏利什曼病流行区的内脏利什曼病患者分别统计阳性率，结果显示内脏利什曼病试条和rK39试条法检测动物源型和人源型流行区的内脏利什曼病患者血样之间阳性率的差异均无统计学意义(χ2=0.22 /0.01，P>0.05)。两种试条法检测动物源型和人源型内脏利什曼病流行区非内脏利什曼病患者血样之间特异性的差异也均无统计学意义(χ2=0.29，P>0.05)。结论快速检测内脏利什曼病的胶体金免疫层析试条适用于检测动物源型内脏利什曼病流行区患者血样中的特异性抗体。

关键词：内脏利什曼病；免疫层析试条；现场评价

Supported by the National Science & Technology Major Program(Nos. 2012ZX10004-220 and 2012ZX10004-201)

内脏利什曼病(visceral leishmaniasis, VL)或称黑热病(kala-azar)，是由杜氏利什曼原虫(Leishmaniadonovani) 或婴儿利什曼原虫(L.infantum) 寄生于人体的淋巴—巨噬细胞系统所引起的一种寄生虫病，由媒介白蛉叮咬传播。内脏利什曼病可分为两种类型，即人源型(Anthroponotic visceral leishmaniasis , AVL) 和动物源型(Zoonotic visceral leishmaniasis , ZVL)，感染虫种分别为杜氏利什曼原虫和婴儿利什曼原虫[1]。自1990年以来，我国黑热病疫情迅速回升，主要分布在新疆、甘肃、四川、陕西、山西和内蒙6省(区)，严重威胁着我国西部人民的生命和健康[2]。发展快速而又准确的诊断技术是治疗和控制该病传播的关键。近年发展起来的免疫胶体金层析试条技术以其快速、简便、敏感、特异的显著优点，特别适合现场应用。 前期本实验室研制了以利什曼原虫前鞭毛体可溶性抗原为包被抗原检测内脏利什曼病特异抗体的快速诊断黑热病的胶体金免疫层析试条，实验室评价显示其检测的敏感性和特异性均为95%以上[3]。为此，我们对此诊断试剂在现场做进一步评价，报道如下。

1材料和方法

1.1研究对象四川省、甘肃省和新疆喀什市疾病预防控制中心的门诊为试验点。四川省和甘肃省为动物源型内脏利什曼病流行区，新疆喀什市为人源型内脏利什曼病流行区。对前来就诊的来自黑热病流行区疑似黑热病患者进行骨髓穿刺，取骨髓涂片3张，甲醛固定，吉姆萨染色，同时取静脉血进行试条测检测。共检测了97例镜检确诊内脏利什曼病病例，其中动物源型内脏利什曼病流行区为69例，人源型黑热病流行区为28例；对来自非黑热病流行区无黑热病暴露史的非黑热病就诊患者取血进行试条检测，共检测145例。

1.2镜检骨髓涂片分别由上述省、市疾病预防控制中心专家进行镜检，本研究组专家进行复核，观察到利什曼原虫无鞭毛体判为阳性，每张片至少在油镜下观察 2 000 个视野而没有发现利什曼原虫无鞭毛体则判为阴性。

1.3内脏利什曼病免疫层析试条的制备和样本检测快速检测内脏利什曼病特异抗体的免疫层析试条为本研究组制备[3]。事先培训上述门诊检验人员，按照文献[3]方法进行测试，即取20 μL全血或10 μL待检血清滴于试条样品垫上，吸干后再加1～2滴(约50～100μL)磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffer Solution pH7.4，PBS)。质控带和检测带均出现红色条带，判为阳性，只有质控带出现红色条带则判为阴性，如果质控带不出现红色条带则说明试条失效。检测结果均在20 min内判断。

1.4rK39免疫层析试条rK39免疫层析试条购自美国InBios公司。检测方法按照操作说明书进行。

1.5统计学分析采用SPSS 11.0 软件对两种方法的检测结果进行χ2检验。P<0.05 有统计学意义。

2结果

2.1内脏利什曼病试条法和rK39试条法检测结果内脏利什曼病试条法和rK39试条法分别检测镜检确诊的内脏利什曼病97例，敏感性分别为98.87%(96/97)，97.94%(95/97)；检测非内脏利什曼病病例145例， 均有2例假阳性反应，特异性为98.62(143/145)(表1)。内脏利什曼病试条法和rK39试条法检测的敏感性之间差异无统计学意义(χ2=0.34，P>0.05),特异性完全相同(表2)。内脏利什曼病试条法检测出的96份内脏利什曼病患者血样中，rK39试条法有1份显示阴性，二者符合率为98.96%。

表1　两种试条法检测内脏利什曼病和非内脏利什曼病患者血样结果

2.2两种试条法检测不同类型内脏利什曼病患者血样结果比较97例内脏利什曼病患者血样中69份来自动物源型内脏利什曼病流行区(四川、甘肃)，28份来自人源型内脏利什曼病流行区(新疆喀什市)，分别统计阳性率，结果显示内脏利什曼病试条和rK39试条法检测动物源型内脏利什曼病流行区和人源型内脏利什曼病流行区内脏利什曼病患者血样之间阳性率的差异均无统计学意义(χ2=0.22 /0.01，P>0.05)(表2)。两种试条分别检测动物源型内脏利什曼病流行区非内脏利什曼病病例血样98例，均有1例假阳性；检测人源型内脏利什曼病流行区非内脏利什曼病病例血样47例，也均有1例假阳性。两种试条法检测动物源型内脏利什曼病流行区和人源型内脏利什曼病流行区非内脏利什曼病患者血样之间特异性的差异均无统计学意义(χ2=0.29，P>0.05)。

表2　两种试条法检测不同类型流行区内脏利什曼病患者血样结果

3讨论

免疫层析试条法是一种快速诊断方法,它将免疫分子亲和原理和免疫印迹法、经典的薄层层析技术相结合。由于其敏感性高、操作简便、损伤性低和报告结果快速而被广泛应用于疾病的诊断[4]。rK39免疫层析试条应用k39抗原(在所有亲内脏利什曼原虫均保守重复氨基酸序列，此抗原仅在疾病活动期表达)作为包被抗原检测利什曼原虫特异抗体，显示很好的检测敏感性和特异性，受到广泛应用[10-11]，有研究者用该试条对我国内脏利什曼病的诊断价值也进行了评价，在现场应用中取得较好的效果，而且可用于低发病率流行区的内脏利什曼病的诊断和筛选[5-9]。由于k39抗原仅在疾病活动期表达，因此，此产品在监测和流行病学调查中的应用受到局限，且该试条价格昂贵，而内脏利什曼病多发于我国西部贫困地区，患者家庭很难承担，也限制了该试条在现场流行病学调查中的应用。因此，亟待开发我国自己的内脏利什曼病免疫诊断试剂盒。

本课题组研制的检测内脏利什曼病的免疫层析试条应用亲内脏利什曼原虫前鞭毛体粗抗原作为包被抗原检测利什曼原虫特异抗体，理论上应有更好的检测敏感性，本次现场检测内脏利什曼病患者血样的敏感性达到98.97%(96/97)，显示了很好的检测敏感性。检测流行区的非内脏利什曼病病例血样和正常人血样也表现出很好的特异性，为98.62(143/145)，与平行检测的rK39试条检测的特异性无差异，且对源自动物源型内脏利什曼病流行区和人源型内脏利什曼病流行区患者血样的检测结果之间的差异无统计学意义。

现场研究表明，本研究组研制的胶体金免疫层析试条用于内脏利什曼病诊断具有较高的敏感性，操作人员不需要特殊的专业知识和技术培训，因此具有广泛的适用性，尤其适用于基层医疗卫生机构。

参考文献：

[1]Guan LR, Qu JQ, Cai JJ. Leishmaniasis in China-present status of prevalence and some suggestions on its control[J].Endem Dis Bull, 2000, 15(3): 49-53. DOI: 10.13215/j.cnki.jbyfkztb.2000.03.023(in Chinese)

管立人，瞿靖琦，柴君杰.中国利什曼病的现状和对开展防治工作的若干的建议[J].地方病通报，2000，15(3)：49-53.

[2]Wang JY, Ha Y, Gao CH, et al. The prevalence of canineLeishmaniainfantuminfection in western China detected by PCR and serological tests[J].Parasit Vectors, 2011, 4: 69-76. DOI: 10.1186/1756-3305-4-69

[3]Yang YT, Shi F, Gao CH, et al. Establishment and evaluation of colloid gold labeled immunochromatographic strip test for rapid detection of visceral leishmaniasis[J].Int J Med Parasit Dis, 2014, 41(3): 121-124. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1673-4122.2014.03.001(in Chinese)

杨玥涛,石锋,高春花,等.快速检测内脏利什曼病特异抗体胶体金免疫层析试条方法的建立与效果评价[J].国际医学寄生虫病杂志,2014,41(3):121-124.

[4]Gao CH, Wang JY. Research progress on the methods for diagnosis of visceral leishmaniasis[J].Int J Med Parasit Dis, 2009, 36(5): 348-354.(in Chinese)

汪俊云，高春花. 内脏利什曼病诊断方法研究进展[J].国际医学寄生虫病杂志，2009,36(5):348-354.

[5]Bern C, Jha SN, Joshi AB, et al. Use of the recombinant K39 dipstick test and the direct agglutination test in a setting endemic for visceral leishmaniasis in Nepal[J].Am J Trop Med Hyg, 2000, 63(3-4): 153-157.

[6]Singh S, Kumari V, Singh N. Predicting kala-azar disease manifestations in asymptomatic patients with latentLeishmaniadonovaniinfection by detection of antibody against recombinant K39 antigen[J].Clin Diagn Lab Immunol, 2002, 9(3): 568-572.

[7]Qu JQ, Guan LR, Shulidan I, et al. Rapid screening with a recombinant antigen(rk39) for diagnosis of visceral leishmanniasis using dipstick[J].Chin J Parasit Dis, 2000, 18(3): 155-158.

[8]Chen SB, Li F, Chen XW, et al. Diagnosis of human and canine visceral leishmanniasis using rk39 dipstick[J].Endem Dis Bull, 2000, 15(4): 86-87. DOI: 10.13215/j.cnki.jbyfkztb.2000.04.043(in Chinese)

陈生邦，李凡，陈效文，等. Rk39免疫层析试条用于诊断甘肃省内脏利什曼病人和病犬[J].地方病通报，2000,15(4):86-87.

[9]Zuo XP, Yi MM, Kai SE, et al. Application of rK 39 dipstick on diagnosis and epidemiological survey of kala-azar in Xinjiang, China[J].J Trop Dis Parasitol, 2007, 5(1): 19-22.(in Chinese)

左新平，伊马木，开赛尔，等. rK39免疫层析试条在新疆黑热病诊断和流行病学调查中的应用[J].热带病与寄生虫学，2007,5(1):19-22.

[10]Burns JM Jr, Shreffler WG, Benson DR, et al. Molecular characterization of a kinesin-related antigen ofLeishmaniachagasithat detects specific antibody in African and American visceral leishmaniasis[J].Proc Natl Acad Sci U S A, 1993, 90(2): 775-779.

[11]Zijlstra EE, Nur Y, Desjeux P, et al. Diagnosing visceral leishmaniasis with the recombinant K39 strip test: experience from the Sudan[J].Trop Med Int Health, 2001, 6(2): 108-113.

DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.01.006

通讯作者：高春花，Email: gaochunhua1976@aliyun.com

中图分类号：R531.6

文献标识码：A

文章编号：1002-2694(2016)01-0024-04

Corresponding author:Gao Chun-hua, Email: gaochunhua1976@aliyun.com

收稿日期：2015-06-25；修回日期:2015-11-12

Evaluation of colloid gold labeled immunochromatographic strip test for rapid detection of canine Leishmanial infection in China

FENG Xiao-ping,GAO Chun-hua,SHI Feng,YANG Yue-tao,WANG Jun-yun

(NationalInstituteofParasiticDiseases,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention/LaboratoryofParasiteandVectorBiology,MinistryofHealth/NationalCenterforInternationalResearchonTropicalDiseases,WHOCollaboratingCentreforMalaria,SchistosomiasisandFilariasis,Shanghai200025,China)

Abstract:We evaluated a colloid gold immunochromatographic strip test(ICT) developed by our laboratory for detection of human visceral leishmaniasis in field. The human blood and bone marrow samples from the zoonotic visceral leishmaniasis endemic areas(Sichun and Gansu provinces) and a anthroponotic visceral leishmaniasis endemic area(Kashi, Xinjiang) of suspected visceral leishmaniasis were collected and subjected to be detected by the microscopy, ICT and rK39. Detection results of the ICT were compared with that of the rK39 and then compared with microscopy findings(taken as a golden standard). It was found that the positive detection rates of ICT and rK39 were 98.87%(96/97) and 97.94%(95/97), respectively. There was no statistical difference in the sensitivity between ICT and rK39(χ2=0.34, P>0.05). Detection on 145 blood samples of patients with non-visceral leishmaniasis showed both specificities of 98.62(143/145) by the ICT and rK39. There was no statistical difference in the sensitivity between samples from the zoonotic visceral leishmaniasis endemic areas and the anthroponotic visceral leishmaniasis endemic area by the ICT(χ2=0.22, P>0.05). It is evident that the ICT for detection the leishmanial specific antibody of human peripheral blood specimens is proved to be a reliable method.

Keywords:visceral leishmaniasis; immunochromatographic strip; field evaluation

国家科技重大专项(No.2012ZX10004-220和2012ZX10004-201)