环介导等温扩增技术在嗜水气单胞菌检测中的应用

孟　双，王　毅，王　艳，叶长芸



环介导等温扩增技术在嗜水气单胞菌检测中的应用

孟双，王毅，王艳，叶长芸

中国疾病预防控制中心传染病预防控制所，传染病预防控制国家重点实验室，北京102206

摘要：目的建立环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)对嗜水气单胞菌检测的方法，并用临床标本对该方法进行评价。方法根据嗜水气单胞菌desA 基因的保守序列设计特异性引物，利用参考质粒评价该检测体系的灵敏度；用30种其他肠道致病菌及院内感染中常见的致病菌评价该检测体系的特异性；用粪便模拟样本以及临床样本评价该检测体系的临床检测的可行性。结果LAMP检测体系对嗜水气单胞菌重组质粒的检测灵敏度为1×102拷贝/反应体系；LAMP检测体系在检测30种其他肠道致病菌及院内感染中常见的致病菌时未出现假阳性；LAMP检测体系在粪便模拟标本中的检测下限为5 × 103 CFU/g；通过与qPCR技术相比较，LAMP具有更高的灵敏度以及更优秀的临床标本的检测能力。结论本研究建立的LAMP方法是首次将LAMP技术运用到了嗜水气单胞菌的检测，所需仪器设备简单，可作为一种快速的筛查方法在临床检验和基层实验室应用。

关键词：嗜水气单胞菌；LAMP；qPCR

Supported by the National Major Science and Technology Project of Prevention and Control in Significant Infectious Diseases(No. 2013ZX10004-101)

嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)是一种革兰阴性、能运动、兼性厌氧、氧化酶阳性的杆状细菌，属于弧菌科、气单胞菌属[1]。嗜水气单胞菌广泛分布于自然界的各种水体，是多种水生动物的原发性致病菌，是典型的人-兽-鱼共患病的病原菌。近年来大量研究表明，嗜水气单胞可单独或者与其他致病菌共同感染，引起人类肠胃炎、败血症以及外伤引起软组织感染等病症[2]，危害食品安全，并且是免疫缺陷病人和肝功能疾病患者的条件致病菌，具有重要的公共卫生意义[3-4]。

目前对于嗜水气单胞菌的检测方法主要有分离培养、普通PCR和实时荧光PCR(qPCR)等分子生物学方法。分离培养方法操作步骤繁琐，检测周期长，一般需要3～5 d完成，不能满足快速检测的需求[5]。最近几年，PCR和qPCR分子生物学检测方法在病原菌检测中的应用越来越广[6-7]，但这些方法的检测成本高，需要精密昂贵的热循环仪器，且对实验环境和操作者的技术也有严格的要求，因此限制了该技术的普遍适用性，不利于在农村地区以及基层实验室的推广应用。

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是Notomi等建立的一种新的核酸扩增方法[8]。其原理是利用4条特殊设计的引物及具有链置换活性的BstDNA聚合酶，在恒温条件下特异、高效、快速的扩增DNA，可以在1 h之内使产物的量达到109个拷贝。最近几年，LAMP以其灵敏度高、特异性好、反应速度快和操作简单等特点在各种病原菌检测中的应用越来越广[9]。本研究的目标是建立一种嗜水气单胞菌的快速、可靠的LAMP技术，并使用粪便模拟标本和实际临床样本对该技术的检测能力进行评价，以期将该项技术在基层实验室及农村地区进行大规模的推广使用。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株来源本实验所用标准菌株购自中国药品生物制品检定所，其他菌株分离自食品、粪便和呕吐物等样品，均经德灵WALKAWAY-40SI全自动微生物分析仪鉴定。用于特异性评价的菌株见表1。

表1　实验用菌株

1.1.2试剂与仪器设备Loopamp Kit (Eiken Chemical Co. Ltd., Tokyo, Japan)购自日本荣研公司。Premix Ex TaqTM、Easy Dilution、pMD18-T载体、JM109 感受态细胞、Ex Taq DNA聚合酶以及小量质粒提取试剂盒均购自大连宝生物工程有限公司。细菌基因组DNA抽提试剂盒购自Promega公司。Loopamp实时浊度仪LA-320(Eiken Chemical Co., Ltd, Japan)购于日本荣研公司。ABI 7900Fsat 实时荧光定量PCR仪为美国应用生物系统公司产品。

1.2方法

1.2.1细菌基因组DNA的提取细菌基因组DNA的提取使用TAKARA公司的MiniBEST试剂盒，按照说明书进行操作。利用紫外分光光度计测定细菌基因组DNA的纯度和浓度，嗜水气单胞菌基因组DNA用EasyDilution缓冲液稀释至5×105～ 5×10-3pg/μL的浓度梯度，阴性对照用EasyDilution缓冲液稀释至5×104pg/μL，各种基因组DNA均少量分装，-20 ℃保存备用。

1.2.2 LAMP引物的设计及LAMP反应体系的建立 根据嗜水气单胞菌特异性基因desA设计交叉反应引物。我们利用多序列比对软件ClustalX 1.83对嗜水气单胞菌的参考菌株进行desA基因的序列比对，在该基因的保守区域使用引物设计软件PrimerExplorer V4 software(http://primerexplorer.jp)(Eiken Chemical Co. Ltd., Tokyo, Japan)在线进行LAMP引物设计，并将设计的引物在NCBI数据库中进行序列比对分析，以排除引物与其他物种序列可能存在的非特异性匹配。引物设计的位置和方向见图1，序列见表2。LAMP的反应体系如下：引物F3和B3的浓度为5 pmol，引物FIP和BIP的浓度为40 pmol，引物LF和LB的浓度为20 pmol，Betain的浓度为2.5 mol/L，MgSO4的浓度为150 mmol/L，dNTP的浓度为10 mmol/L，BstDNA polymerase 的浓度为8 U，模板为2 μL，补加去离子水至25 μL。整个反应在LA320实时浊度仪中进行，等温扩增65 ℃1 h，80 ℃5 min终止反应。由于扩增产物是一系列反向重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段混合物，扩增产物可以通过凝胶电泳进行检测；LAMP在合成DNA的同时还产生大量的焦磷酸根离子，它们能与镁离子结合生成白色的焦磷酸镁沉淀，扩增产物也可以通过浊度进行检测。

1.2.3评价LAMP检测技术的灵敏度和特异性 含desA基因的质粒标准品的构建与制备 ①使用desA特异引物进行PCR扩增后得到目的片段；②切胶回收，纯化PCR 产物；③连接到T载体；④转化JM109 感受态细胞；⑤筛选阳性克隆子，用PCR 进行验证，最终测序确认；⑥提取质粒，根据质粒的分子量将质粒样品浓度换算为拷贝数浓度：每μL样品中检测基因的拷贝数=浓度(ng/μL)×阿佛加德罗常数×10-9/(660×重组质粒碱基数)；⑦用Easy Dilution将上述质粒依次稀释成1.0×100拷贝/μL～1.0×106拷贝/μL，共7个浓度梯度。

1.2.3.1LAMP检测的灵敏度评价取质粒标准品加入每反应体系100拷贝至106拷贝为模板，每个浓度进行3次重复，评价LAMP检测体系的灵敏度。

1.2.3.2LAMP检测的特异性评价以常见致病菌及条件致病菌DNA(见表1)为模板评价LAMP体系的特异性。

1.2.4LAMP与qPCR技术检测能力比较qPCR技术对嗜水气单胞菌的检测(本科室建立)所用的引物探针见表1。qPCR的反应总体系为20 μL，含2×Premix(TaKaRa) Ex TaqTM 10 μL、10 μmol/ L的引物探针各0. 4 μL、DNA 模板1 μL，补加去离子水至20 μL。在ABI 7900实时荧光定量PCR仪上扩增并测定结果，PCR 循环参数：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃延伸34 s，共40个循环。扩增结束后，扣除本底荧光信号后取同一阈值分析数据，确定各样本的Ct(cycle threshold) 值。通过灵敏度、特异性这两方面对这两种检测技术进行比较。LAMP技术的反应体系和反应参数如上所述。

1.2.5评价LAMP技术在粪便模拟样本中的应用①嗜水气单胞菌(ATCC7966)摇菌至对数生长期。②用磷酸盐缓冲液将该菌培养物进行10倍连续稀释，并进行平板计数。③取健康人新鲜粪便0.2 g/管，分别加入100 μL不同浓度的嗜水气单胞菌稀释悬液，制成5×101～ 5×106CFU/g 梯度浓度的粪便模拟标本。④应用QIAamp DNA stool mini kit(QIAGEN, Venlo, Netherlands)试剂盒抽提所有粪便标本，每个菌浓度进行3次重复，平行独立提取DNA进行qPCR和LAMP检测。

1.2.660份临床样本的检测60份腹泻病人的粪便标本分别进行分离培养鉴定、qPCR和LAMP检测。培养分离方法的操作步骤如下。首先标本使用碱性蛋白胨水(APW, pH 8.5)进行增菌过夜培养，然后取适量接种于嗜水气单胞菌的选择性培养基(Ryan, OXOID, 英国)。该培养基在30 ℃～35 ℃孵育18 h后，挑选疑似嗜水气单胞的菌落(青绿色，菌落中心为不透明的深绿色)进行生化鉴定。接着将初步鉴定为嗜水气单胞菌的菌株进行管家基因rpoD的扩增和测序，将测序结果在GenBank上用Blast进行比对，最后对嗜水气单胞菌株进行确认。LAMP和qPCR的检测体系如前所述。将适量的碱性蛋白胨水增菌液使用DNA提取试剂盒(QIAamp DNA minikits; Qiagen, Hilden, 德国)提取核酸后，吸取2 μL作为qPCR和LAMP的模板。

表2　实验中所用引物

2结果

2.1目的基因片段的克隆实验获得的desA扩增片段分子量大小与预期结果一致，将所得片段连接到T载体转化受体菌获得克隆子中，经测序验证，所获阳性克隆包含的目的片段序列完全正确。

2.2LAMP检测体系的灵敏度LAMP和qPCR针对desA基因的检测下限分别为20 拷贝每反应体系(Fig.2A)和200 拷贝每反应体系，显示LAMP在检测嗜水气单胞菌DNA时比qPCR方法更灵敏。LMAP的扩增结果可以用电泳方法来检测(Fig. 2B)，也可以通过加入Loopamp荧光染料(FD)通过肉眼观察颜色的改变来检测(Fig.2C)。当存在阳性扩增时，FD染料的桔色快速变为绿色，在黑色背景下更为显著；当扩增为阴性时，管内颜色维持桔黄色不变。

2.3LAMP检测方法的特异性评价30株嗜水气单胞菌核酸检测均在1 h内出现了阳性扩增，33株非嗜水气单胞菌核酸检测都未出现扩增，说明该LAMP检测技术的特异性好。

2.4LAMP检测技术在粪便模拟样本中的应用LAMP检测技术在粪便模拟标本中的检测下限为5×103CFU/g，相比之下，qPCR针对desA基因在粪便模拟标本中的检测下限为5×104CFU/g，说明LAMP比qPCR对粪便模拟标本的检测更灵敏。

2.5LAMP检测技术在临床标本中的应用结果发现LAMP技术能检测出嗜水气单胞菌阳性标本9份，而qPCR技术只能检测出嗜水气单胞菌阳性标本7份，并且LAMP的检测结果与分离培养方法相一致(见表3)，说明LAMP技术对临床标本的检测能力优于qPCR。因此LAMP检测可作为一种快速的嗜水气单胞菌的筛查方法在基层实验室及现场处理疫情时进行推广使用。

3讨论

(A)通过检测产物的浊度变化来评价LAMP检测的灵敏度。1-6:质粒模板浓度分别为2.0×107～1.0×102 拷贝每反应体系，检测下限为20 拷贝每反应体系。(B) 通过琼脂糖凝胶电泳来评价LAMP检测的灵敏度。1-8:质粒模板浓度分别为2.0×107～1.0×100 拷贝每反应体系，检测下限为20 拷贝每反应体系。(C) LAMP的扩增产物可以通过加入FD荧光染料来检测。发生阳性扩增时，产物的颜色由最初的橙黄色变为绿色；而阴性扩增的颜色则不会发生改变。

表3　LAMP技术在临床样本检测中的应用

近几年来，嗜水气单胞菌作为一种突发的食源性疾病受到越来越多的重视。来自西班牙国家传染病预防控制中心的数据表明在1997-2006年间所有引起胃肠疾病的细菌中，嗜水气单胞菌位居第四位[10]。2014年印度研究者[11]报道了1例嗜水气单胞菌感染引起坏死性筋膜炎导致患者死亡的病例，受到了国内外的高度重视。随着嗜水气单胞菌诱发病例的增多，环境保护署(EPA)已经将该菌列入潜在的水传播病原菌的候选名单[12]。因此，为了给予临床病人准确快速的治疗和嗜水气单胞菌的流行病学调查，研发一个操作简单、灵敏度高和特异性好的嗜水气单胞菌检测方法成为必要。

虽然嗜水气单胞菌诱发肠胃炎的致病机理并未完全阐明，但研究者已经对一些潜在的毒力因子进行了深入的研究。摄取铁离子与一些病原菌的毒力密切相关，人体中的亚铁血红素是病原菌铁离子的一个重要来源，并且许多病原菌本身就具有亚铁血红素运输系统，desA基因是编码嗜水气单胞菌亚铁血红素铁离子利用系统的重要基因之一[13]，并且编码一种外膜蛋白受体，可以从环境中摄取细菌生长和存活所必需的铁离子，因此是一个理想的检测目的基因。

传统的细菌培养和生化鉴定方法费时费力。目前常用的嗜水气单胞菌商品化检测系统(API和Vitek, bioMérieux)能够进行属水平的鉴定，通常需要24 h，但该过程却忽略了对温度和培养基有明显依赖的脱羧酶和水解酶反应，在将嗜水气单胞菌与其他密切相近的菌种进行区分时出现了困难[5,14]。PCR技术和qPCR技术的检测成本高，需要精密昂贵的热循环仪器，且对实验环境和操作者的技术也有严格的要求，因此限制了该技术的普遍适用性，不利于基层实验室的推广应用。相比之下，LAMP检测技术则具有很多的优势：1)LAMP对靶序列扩增效率高，体系中其他共存非靶DNA对其扩增的影响较小。LAMP的检测下限为几个拷贝，灵敏度远远高于普通PCR技术，有研究者证实LAMP的灵敏度等于甚至高于qPCR的检测灵敏度。2) 产物检测方便、快捷。因为LAMP在合成各种茎环DNA的同时还产生大量的副产物—焦磷酸盐，并且生成白色的焦磷酸镁沉淀物。Mori等[8-9]利用这些特性来检测LAMP产物，可以直接根据沉淀的形成来定性的判断扩增反应是否发生，还可以通过检测其产物浊度的变化进行实时定量检测。3) LAMP对靶序列扩增的特异性高。由于LAMP通过4条引物与靶序列上的6个特异部位准确结合来产生扩增效应，因此可以获得比PCR更高的特异性。4) 设备要求简单，易操作。LAMP反应只需要一个普通的水浴锅或者恒温装置，不需要昂贵的PCR仪。5) 反应速度快。LAMP是恒温扩增反应，没有PCR反应中温度变化的耗时，一般在30 min～60 min内即可完成，比普通PCR和qPCR反应速度更快，能更好的满足临床快速检测的要求。另外，在LAMP反应体系中增加2条环引物可使反应所需时间比原来缩短一半，整个反应可以在40 min内完成，大大提高了检测效率。这些特性使得LAMP技术更适用于在基层实验室及现场处理疫情时使用。

本研究首次使用了LAMP技术对嗜水气单胞菌进行了检测。LAMP检测体系对嗜水气单胞菌重组质粒的检测灵敏度为1×102拷贝每反应体系，并在检测30种其他肠道致病菌及院内感染中常见的致病菌时未出现假阳性；LAMP检测体系在粪便模拟标本中的检测下限为5×103CFU/g，在60份临床标本中检出嗜水气单胞菌阳性标本9份，该检测结果与分离培养结果相一致。通过对LAMP检测技术和qPCR检测技术进行比较，我们发现LAMP技术无论在检测灵敏度上还是在检测速度上都优于qPCR。一般情况下，以分子水平为基础的检测方法例如PCR和qPCR都会受临床标本中抑制物的影响，一些研究者报道LAMP使用的BstDNA聚合酶对样品中抑制物的耐受能力比qPCR中的Taq酶要强[15]，因此，LAMP比qPCR具有更广阔的临床应用前景。

总之，本研究建立的LAMP方法是首次将LAMP技术运用到了嗜水气单胞菌的检测，该方法在1 h内就可以观察结果，满足了临床快速诊断的需要，并且该方法对临床样本的灵敏度高于qPCR法，反应时间更快，所需仪器设备简单，可作为一种快速的筛查方法在临床检验、检疫及基层实验室进行推广应用。

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DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.01.001

通讯作者：叶长芸，Email：yechangyun@icdc.cn

中图分类号：R378

文献标识码：A

文章编号：1002-2694(2016)01-0001-06

Corresponding author:Ye Chang-yun, Email:yechangyun@icdc.cn

收稿日期：2015-06-19；修回日期:2015-07-24

Loop-mediated isothermal amplification assay for the detection of Aeromonas hydrophila

MENG Shuang,WANG Yi,WANG Yan,YE Chang-yun

(StateKeyLaboratoryforInfectiousDiseasePreventionandControl,NationalInstituteforCommunicableDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterofDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China)

Abstract:To develop a sensitive and specific loop-mediated isothermal amplification(LAMP) assay for the detection of Aeromonas hydrophila, a set of 6 primers targeted toward the desA gene of the A. hydrophila was designed using PrimerExplorer V4 software(Eiken Chemical Co. Ltd., Tokyo, Japan) based on the conserved sequences. The performance of the assay with reference plasmids, simulated human stools, and clinical specimens were evaluated and compared with quantitative PCR(qPCR). No false-positive results were observed for the 33 non-A. hydrophila strains used to evaluate assay specificity. The sensitivity of the LAMP assay was approximately 20 copies per reaction in reference plasmids and 5×103 CFU per gram in spiked human stool, which were more sensitive than the results of qPCR. The performance of the LAMP assay was evaluated with clinical specimens, which had the better detection ability than qPCR. In conclusion, the LAMP assay developed in this study is a valuable method for rapid, cost-effective, and simple detection of A. hydrophila in basic clinical and field laboratories.

Keywords:Aeromonas hydrophila; loop-mediated isothermal amplification; qPCR

国家重大传染病防治科技重大专项(2013ZX10004-101)资助