厌氧处理对桑叶GABA含量的影响

龚 铄， 周防震

(湖北民族学院生物科学与技术学院，湖北恩施 445000)



厌氧处理对桑叶GABA含量的影响

龚 铄， 周防震*

(湖北民族学院生物科学与技术学院，湖北恩施 445000)

摘要[目的]探讨厌氧处理对桑叶中γ-氨基丁酸(GABA)含量的影响，为桑叶中功能性成分的开发利用提供参考。[方法]分别采用CO2厌氧和真空厌氧处理桑叶鲜叶，经杀青、烘干和粉碎后，利用丙酮和AlCl3去除桑叶色素，分光光度法测定桑叶中GABA的含量。[结果]未厌氧处理的桑叶中GABA含量为0.915 mg/g；而CO2厌氧处理4 h，GABA含量达到最高值1.214 mg/g；真空厌氧处理8 h，GABA含量达到最高值1.453 mg/g。[结论]一定时间的CO2厌氧或真空厌氧处理均能显著提高桑叶中GABA含量，真空厌氧处理可得到更高GABA含量的桑叶。

关键词桑叶；γ-氨基丁酸；厌氧处理

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)是哺乳动物中枢神经系统中的一种重要的抑制性神经递质[1]，广泛存在于动植物体内，具有降血压、保持神经安定、改善大脑机能和增强记忆等多种药理作用[2]，具有较大的开发和利用价值。将普通的鲜茶叶经过一定时间的厌氧处理使谷氨酸在谷氨酸脱羧酶作用下脱去羧基，生成GABA，国内外已有报道，并已有产品销售。如日本学者通过厌氧和应激处理，使普通春茶中GABA的含量达到2.02 mg/g(干重)，夏茶GABA的含量达到0.86～1.14 mg/g(干重)[3]，而普通加工的茶叶虽然谷氨酸的含量丰富，达到1.78～4.95 mg/g，但GABA含量只为0.2～2.0 μmol/g(干重)[4]，相当于0.02～0.22 mg/g(干重)。

桑叶是桑科植物桑的干燥叶，现代中、西医把桑叶和桑叶生物制剂作为改善糖尿病及其他各种疑难杂症的药物而使用，认为其药效极为广泛。研究表明，桑叶干品中GABA平均含量为2 260 mg/kg[5-7]，但有关厌氧处理对桑叶GABA含量影响的研究尚少见报道。笔者以桑叶为材料，探讨厌氧处理对桑叶中GABA含量的影响，以期为桑叶中功能成分的开发和利用奠定基础。

1材料与方法

1.1.1原料与试剂。桑叶，2015年9月中旬采自湖北民族学院实验示范中心，树龄30年左右。PET/PE透明真空包装袋，河北东光县立新塑料包装有限公司；CO2厌氧产气袋及2.5 L密封罐，日本三菱瓦斯化学株式会社。丙酮、无水三氯化铝和氢氧化钾，天津市福晨化学试剂厂；无水乙醇、次氯酸钠和γ-氨基丁酸标品，国药集团化学试剂有限公司；重蒸酚，北京索莱宝科技有限公司；四硼酸钠，天津市天达净化材料精细化工厂。以上试剂均为分析纯。

1.1.2主要仪器设备。小型高速冷冻离心机，Eppendorf公司；精密pH计(PHS-4C型)，成都方舟科技开发公司；恒温水浴锅(HH-4)，金坛市科兴仪器厂；粉碎机，广东天际电器有限公司；电子天平，上海精天电子仪器有限公司；紫外可见分光光度计，上海棱光技术有限公司；电热恒温干燥箱，上海一恒科技有限公司；移液枪，Eppendorf公司；DZ-280/DZ-300A小型真空包装机，温州卓越机电有限公司。

1.2方法

1.2.1桑叶的处理。分别取新鲜桑叶100 g，室温、真空和CO2厌氧条件下处理0、4、8和12 h。微波(110～115 ℃)杀青1～2 min，每30 s拌匀1次。然后80 ℃干燥至恒重，粉碎后过40目筛，置干燥器备用。各处理重复4次。

1.2.2桑叶中GABA的提取。称取0.5 g桑叶干样，加入装有7 mL丙酮的离心管中，室温振荡15 min，8 000 r/min离心15 min，弃上清。分别再加7 mL和5 mL丙酮，重复上述过程，沉淀静置干燥。待完全干燥后，加水5 mL，50 ℃水浴中振荡提取2 h，8 000 r/min离心15 min，小心取出上清液(体积为V)，低温保存备用。

1.2.3桑叶中GABA的含量测定。分别取1 mL样品提取液，加入2 mol/L的AlCl3溶液50 μL，混匀后室温振荡15 min，12 000 r/min离心5 min，取上清0.5 mL加入1 mol/L的KOH溶液300 μL，室温振荡5 min，12 000 r/min离心5 min。分别取上清液300 μL，加0.1 mol/L的四硼酸钠缓冲溶液500 μL(pH 10.0)，6%的重蒸酚400 μL，混匀后再加入600 μL 5%的NaClO溶液，充分混匀。于沸水浴中加热10 min，立即置水浴中5 min，待溶液出现蓝绿色后，加入2.0 mL 60%乙醇，于645 nm波长处测定吸光值。桑叶中GABA的含量按下式计算：

GABA质量比(mg/g)=C×V/m

式中，C为由直线方程计算的值(mg/mL)；V为样品提取液的总体积(mL)；m为样品质量(g)。

1.2.4标准曲线的绘制。准确称取GABA标准品0.010 g，用蒸馏水溶解，定容至10 mL，配制成不同浓度的标准溶液。分别取1 mL不同浓度的标准液，同“1.2.3”处理。以吸光值为纵坐标，GABA的浓度(mg/mL)为横坐标，绘制标准曲线。

2结果与分析

2.1CO2厌氧处理对桑叶GABA含量的影响图1显示，CO2厌氧处理桑叶0～12 h，桑叶中GABA含量呈现先增加后减少又少量增加的趋势，其中处理4 h时GABA含量达到最高值，处理8 和12 h时GABA含量显著低于处理4 h的GABA含量。

图1　CO2厌氧处理对桑叶GABA含量的影响Fig. 1　Effects of CO2 anaerobic treatment on the GABA content in mulberry leaf

2.2真空厌氧环境下桑叶GABA的含量及其变化图2显示，真空厌氧处理桑叶0～12 h，桑叶中GABA含量呈现先减少后增加，然后又减少的趋势，其中处理4 h时GABA含量最低，处理8 h时GABA含量达到最高。

图2　真空厌氧处理对桑叶中GABA含量的影响Fig.2　Effects of vacuum anaerobic treatment on the GABA content in mulberry leaf

2.3标准曲线的绘制以GABA的浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。由图3可见，GABA含量在0.062 5～1.000 0 mg/mL范围内，浓度与645 nm波长下的吸光值之间具有良好的线性关系：Y=0.692 88X+0.090 71，决定系数R2=0.995 58。

图3　GABA标准曲线Fig.3　GABA standard curve

2.4桑叶中GABA含量的测定根据图3标准曲线计算，未厌氧处理桑叶中GABA的含量为0.915 mg/g ；CO2厌氧处理4 h后桑叶中GABA的含量1.214 mg/g，真空厌氧处理8 h后桑叶中的GABA含量为1.453 mg/g(表1)。

表1厌氧处理桑叶中GABA的含量

Table 1The GABA content of mulberry leaf in anaerobic treatments

处理TreatmentOD645GABAmg/g未厌氧Noanaerobictreatment0.1860.915CO2厌氧4hCO2anaerobictreatmentfor4h0.2251.214真空厌氧8hVacuumanaerobictreatmentfor8h0.2611.453

3结论与讨论

高等植物中GABA的合成主要由L-谷氨酸脱羧而来，这一反应由L-谷氨酸脱羧酶催化。研究表明，厌氧处理可激活L-谷氨酸脱羧酶的活性[5]，进而可间接增加植物中GABA的含量。从该试验结果可以看出，未厌氧处理桑叶中GABA含量为0.915 mg/g，这与夏玉玲等报道的目前生产上主要栽培的23个桑树品种的GABA含量基本一致[1]。其他文献报道桑叶中GAGA的含量(2.260 mg/g干重)[6-7]，而该研究中桑叶GABA的含量明显偏低，原因可能与桑叶品种、树龄、采摘季节等因素有关系。该研究显示，真空厌氧处理8 h时桑叶中GABA的含量为1.453 mg/g，CO2厌氧处理4 h时桑叶中GABA的含量为1.214 mg/g，表明这2种厌氧处理均可增加L-谷氨酸脱羧酶的活性，进而显著增加桑叶中的GABA含量。

有研究指出，当植物受到厌氧、冷激和机械伤害等逆境条件时，体内GABA 含量将显著增加，其中以低氧厌氧逆境效果最佳[5]。该研究中CO2厌氧条件下，桑叶中GABA含量先增加后减小，可能与CO2厌氧产气袋吸收密封罐中O2，释放CO2过程中，早期尚有低浓度O2有关。低氧胁迫条件下，植物通过磷酸戊糖途径减少有毒物质的积累，生成谷氨酸和GABA以抵御逆境胁迫，调节细胞酸度，在此条件下，谷氨酸脱羧酶活性得到激活，促使谷氨酸向GABA的转化[8]。而真

空厌氧条件下，桑叶中GABA含量呈现先减少后增加再减少的趋势，则可能与真空包装袋中缺氧、低压、无氧呼吸代谢等诸多因素有关。林智等研究发现，采用真空或CO2处理普通茶，对增加茶叶中GABA含量的效果明显优于N3厌氧处理，其中真空处理最优，最佳条件为：真空、25 ℃、8 h[9]。综合比较可以看出，利用CO2厌氧产气袋吸收密封罐中O2，能较快地提高桑叶中GABA含量；而通过真空包装袋抽真空造成厌氧环境的处理方式，提高桑叶中GABA含量则可能需要更长的时间，但其提高潜力优于CO2厌氧处理。

参考文献

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[2] 张辉,徐满英.γ-氨基丁酸作用的研究进展 [J].哈尔滨医科大学学报，2006,6(3)：267-269.

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[4] 廖明星.茶叶中γ-氨基丁酸(GABA)富集技术研究[D].南京：南京农业大学,2004.

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[6] 冀宪领,盖英萍,陈恒文,等.桑叶中γ-氨基丁酸含量的测定及其影响因素的研究[J].蚕业科学,2007,33(2):176-180.

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[9] 林智,林钟鸣,尹军峰,等.厌氧处理对茶叶中γ-氨基丁酸含量及其品质的影响[J].食品科学,2004,25(2):35-39.

基金项目国家级大学生创新训练计划项目(201310517007)；2014年度湖北省本科高校“专业综合改革”试点项目。

作者简介龚铄(1994- )，男，湖北恩施人，本科生，专业：生物工程。*通讯作者，副教授，博士，从事天然产物开发研究。

收稿日期2016-04-25

中图分类号S 888.2

文献标识码A

文章编号0517-6611(2016)15-071-02

Effects of Anaerobic Treatment on GABA Content in Mulberry Leaves

GONG Shuo, ZHOU Fang-zhen*

(School of Biological Science and Technology, Hubei University for Nationalities, Enshi, Hubei 445000)

Abstract[Objective] To research the effects of anaerobic treatment on GABA content in mulberry leaves, and to provide references for the development and utilization of functional components in mulberry leaves. [Method] Fresh leaves of mulberry were processed by CO2 anaerobic treatment and vacuum anaerobic treatment. After mulberry leaves were fixed, dried and shattered, acetone and AlCl3 were used to eliminate the pigments effectively. GABA content in mulberry leaves was detected by spectrophotometry method. [Result] GABA content in mulberry leaves without anaerobic treatment was 0.915 mg/g; while after CO2 anaerobic treatment for 4 h, GABA content reached the maximum value of 1.214 mg/g. After vacuum anaerobic treatment for 8 h, GABA content reached the maximum value of 1.453 mg/g. [Conclusion] CO2 anaerobic treatment and vacuum anaerobic treatment in a given time can both significantly enhance the GABA content in mulberry leaves. And vacuum anaerobic treatment make a GABA content more than CO2 anaerobic treatment..

Key wordsMulberry leaf; GABA; Anaerobic treatment