大肠杆菌对体外培养的奶牛乳腺上皮细胞bFGF及其受体FGFR2表达的影响

于亚娟，王凤龙，丁玉林，毕艳楠

(内蒙古农业大学兽医学院，内蒙古呼和浩特 010018)



大肠杆菌对体外培养的奶牛乳腺上皮细胞bFGF及其受体FGFR2表达的影响

于亚娟，王凤龙*，丁玉林，毕艳楠

(内蒙古农业大学兽医学院，内蒙古呼和浩特 010018)

摘要[目的]探讨大肠杆菌(Escherichia coli)对体外培养的奶牛乳腺上皮细胞(BMEC)bFGF及其受体FGFR2表达的影响。[方法]取热灭活的0、105、106和108 CFU/mL浓度的大肠杆菌作用于体外培养的奶牛乳腺上皮细胞，分别在作用后6、12、24和48 h，采用荧光定量PCR和Western blot方法检测bFGF和FGFR2的mRNA和蛋白的表达情况。[结果]bFGF mRNA表达与对照组相比随着大肠杆菌浓度的升高而显著上调(P<0.01)，24 h bFGF表达量最高。BMEC bFGF蛋白表达随着大肠杆菌浓度的增加而上调，24 h表达量达到最高；FGFR2 mRNA相对表达量除6 h组外随大肠杆菌浓度的增加而呈现降低、升高、降低的变化趋势，48 h表达量达到最高。各处理组与对照组相比FGFR2蛋白表达随时间的延长、菌液浓度的增加而上调。[结论]大肠杆菌刺激奶牛乳腺上皮细胞可以明显促进bFGF和FGFR2的表达，具有浓度和时间依赖性。

关键词bFGF；FGFR2；大肠杆菌；奶牛乳腺上皮细胞

奶牛乳腺炎是奶牛最常见、最多发且造成经济损失最大的疾病之一。该病可使奶牛泌乳机能受损，生殖机能失调，奶牛福利受损，引起产奶量下降[1]，严重者可引起泌乳机能完全丧失，导致乳腺纤维化。大肠杆菌是引起奶牛乳腺炎是主要原因之一，大肠杆菌感染大多引起严重的临床症状，导致临床型乳腺炎[2]。大量研究表明，bFGF(Basic fibroblast growth factor-2，bFGF2)是一种广泛的有丝分裂原，可通过自分泌或旁分泌的方式来促进包括肿瘤细胞及血管内皮细胞在内的多种细胞的增殖、分化和抗凋亡作用[3]，bFGF是通过与成纤维细胞生长因子受体(Fibroblast growth factor receptors，FGFRs)结合发挥其生物学效应，FGFR2又是其高亲和力受体。研究表明，bFGF可诱导体外肾小管上皮细胞向细胞外基质(EMT)转化[4]。据报道，bFGF在肝纤维化中晚期主要是促进ECM的产生[5]。FGF2/FGFR 信号通路在多种组织细胞向肌成纤维细胞转分化过程中起到了重要作用，包括上皮细胞、内皮细胞和肿瘤细胞[6]。然而，bFGF及其受体FGFR2在奶牛乳腺纤维化过程中的作用却鲜有报道。笔者以热灭活大肠杆菌作用于奶牛乳腺上皮细胞检测 bFGF及FGFR2的相对表达量，以期为探讨大肠杆菌感染与乳腺上皮细胞表达bFGF、FGFR2相互关系及bFGF在奶牛乳腺纤维化的作用提供研究依据。

1材料与方法

1.1菌株、细胞及主要试剂大肠杆菌由内蒙古农业大学兽医学院病理解剖实验室分离、鉴定并保存[7]；BMEC由内蒙古农业大学兽医学院病理解剖实验室保存[8]。DMEM/F12干粉培养基，购自Gibco公司；RNAisoPlus裂解液(批号为D910008A)、反转录试剂盒(批号为DRR036A)、SYBR PremixExTaq(批号为DRR041A)、DNA Marker，均购自宝生物工程(大连)有限公司；小鼠β-actin 抗体，购自天津三箭生物技术有限公司；bFGF 鼠抗单克隆抗体(MA1-24682)，购自Millipore公司；FGFR2兔抗单克隆抗体(ab109372)，购自Abcom公司；蛋白裂解液、BCA 蛋白浓度测定试剂盒、山羊抗小鼠 IgG-HRP 和山羊抗兔 IgG-HRP，均购自碧云天生物技术研究所；蛋白酶抑制剂、TBS封闭液、ECL化学超敏显影液(34095)和蛋白预染Marker，均购自Thermo公司。

1.2处理组菌株的制备将冻存的大肠杆菌在37 ℃下24 h 复苏并扩菌培养，采用琼脂平板活菌计数法检测菌液浓度，用无血清的DMEM/F12 培养液将大肠杆菌菌液倍比稀释至105、106和108CFU/mL，70 ℃下热灭活30 min ，血琼脂鉴定，无菌落生长后即可作为处理组菌液。

1.3细胞处理将实验室冻存的 3～4 代BMEC 复苏培养，计数后，按1×105个/mL 密度接种于6孔细胞培养板，细胞铺满后，无血清饥饿处理24 h。处理组加入105、106和108CFU/mL大肠杆菌热灭活菌液，以无血清DMEM/F12培养液为对照组，分别作用 6、12、24和48 h。

1.4引物的设计与合成根据 GenBank数据库中奶牛bFGF、FGFR2和β-actin的mRNA 序列，用 Primer 5.0软件设计引物，引物由大连宝生物有限公司合成。具体引物序列和产物长度见表1。

表1　引物序列及产物长度

1.5实时荧光定量PCR检测大肠杆菌对奶牛乳腺上皮细胞bFGF 和FGFR2 mRNA表达的影响将成熟的贴壁细胞按照TaKaRa RNAiso Plus试剂盒说明书提取总 RNA。取适量的RNA溶液，使用酶标仪检测其OD260和OD280，计算OD260/OD280，判断RNA纯度，并用琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。

以制备的cDNA为模板，利用特异引物，通过qPCR方法扩增 bFGF、FGFR2和β-actin基因，利用2-ΔCt(△Ct=目的基因的Ct值-β-actin的Ct值)公式计算目的基因在奶牛乳腺上皮细胞中相对表达量。

1.6采用Wesrern blot 技术检测大肠杆菌对奶牛乳腺上皮细胞中bFGF 和FGFR2蛋白表达的影响BMEC 经饥饿处理24 h后弃掉培养基，大肠杆菌菌液分别作用6、12、24和48 h，用PBS清洗后，加入裂解液，冰上裂解。刮取细胞，吸出裂解液，12 000 r/min 4 ℃下离心10 min。取上清液，采用BCA 法测定蛋白浓度，通过Western blot 检测相关蛋白的表达。

2结果与分析

2.1实时荧光定量PCR检测不同浓度大肠杆菌对奶牛乳腺上皮细胞 bFGF、FGFR2的标准曲线与熔解曲线利用内参基因 β-actin 和目的基因bFGF、FGFR2 进行 qPCR 检测，并绘制标准曲线。从图1可以看出，其引物反应性良好，产物单一，可得到良好的定量结果。

注：A.bFGF qPCR的标准曲线和熔解曲线；B.FGFR2 qPCR的标准曲线和熔解曲线。Note：A.Standard curve and melting curve of bFGF by qPCR；B.Standard curve and melting curve of bFGF by qPCR.图1　bFGF、FGFR2 qPCR的标准曲线和熔解曲线Fig.1　Standard curve and melting curve of bFGF and FGFR2 by qPCR

2.2实时荧光定量PCR技术检测不同浓度大肠杆菌对奶牛乳腺上皮细胞 bFGF mRNA表达的量效关系从图2可以看出，当不同浓度的大肠杆菌菌液(105、106、108CFU/mL)作用于奶牛乳腺上皮细胞6、12、24、48 h后，bFGF mRNA的表达量与对照组相比极显著增加(P<0.01)。在相同时间点，bFGF mRNA的表达量随大肠杆菌菌液浓度的增加而增加，105、106、108CFU/mL大肠杆菌处理组bFGF mRNA的表达量均在24 h达到最大，24 h后bFGF mRNA的表达量有所降低。在相同浓度，bFGF mRNA的表达量随时间的延长而增加，24 h bFGF mRNA的表达量达到最高，此后mRNA表达量降低。

注：**表示与阴性对照组差异极显著(P <0.01)。Note：** indicated extremely significant differences with negative control group(P <0.01). 图2　bFGF mRNA在不同浓度大肠杆菌中作用不同时间的相对表达量变化Fig.2　Changes of the bFGF mRNA relative expression quantity with different concentrations of Escherichia coli at different time points

2.3实时荧光定量PCR技术检测不同浓度大肠杆菌对奶牛乳腺上皮细胞FGFR2 mRNA表达影响的量效关系从图3可以看出，106CFU/mL大肠杆菌处理组FGFR2 mRNA表达量在24 h与阴性对照组差异显著(P<0.05)，FGFR2 mRNA表达量在12、24、48 h不同浓度大肠杆菌处理组均随大肠杆菌菌液浓度的增大呈现出先降低后升高再降低的变化趋势。

注：* 表示与阴性对照组差异显著(P<0.05)。Note：* indicated significant differences with negative control group(P<0.05). 图3　FGFR2 mRNA在不同浓度大肠杆菌中作用不同时间的相对表达量 Fig.3　Changes of the FGFR2 mRNA relative expression quantity in BMEC with different concentrations of Escherichia coli at different time points

2.4大肠杆菌对奶牛乳腺上皮细胞 bFGF蛋白表达的影响从图4和图5可以看出，除12 h外，各浓度大肠杆菌处理组与阴性对照组差异极显著(P<0.01)。同一时间点，bFGF蛋白表达量随菌液浓度的增大呈现先升高再降低后升高的趋势。在相同浓度大肠杆菌，bFGF蛋白表达量随时间的延长而增加，24 h达到最大值。

注：1.阴性对照组；2.105 CFU/mL大肠杆菌处理组；3.106 CFU/mL大肠杆菌处理组；4.108 CFU/mL大肠杆菌处理组；A.6 h;B.12 h;C.24 h;D. 48 h。Note：1.Negative control group；2.105 CFU/mL E.coli treatment group；3.106 CFU/mL E.coli treatment group；4.108 CFU/mL E.coli treatment group；A.6 h；B.12 h；C.24 h；D.48 h.图4　不同浓度大肠杆菌作用于奶牛乳腺上皮细胞不同时间点后β-actin 和bFGF 的Western blot检测Fig.4　Western blot detection of β-actin and bFGF in BMEC treated with heat-inactivated Escherichia coli at different concentrations and time points

注：**表示与阴性对照组差异极显著(P<0.01)。Note：** indicated extremely significant differences with negative control group(P<0.01).图5　bFGF蛋白在不同浓度大肠杆菌中作用不同时间的相对表达量变化Fig.5　Changes of bFGF relative expression quantity with different concentrations of Escherichia coli at different time points

注：1.阴性对照组；2.105 CFU/mL大肠杆菌处理组；3.106 CFU/mL大肠杆菌处理组；4.108 CFU/mL大肠杆菌处理组；A.6 h;B.12 h;C.24 h;D. 48 h。Note：1.Negative control group；2.105 CFU/mL E.coli treatment group；3.106 CFU/mL E.coli treatment group；4.108 CFU/mL E.coli treatment group；A.6 h；B.12 h；C.24 h；D.48 h.图6　不同浓度大肠杆菌作用不同时间BMEC中β-actin 和 FGFR2的Western blot 检测Fig.6　Western blot detection of β-actin and FGFR2 in BMEC treated with heat-inactivated Escherichia coli at different concentrations and time points

注：*表示与阴性对照组差异显著(P<0.05)；**表示与阴性对照组差异极显著(P<0.01)。Note：* indicated significant differences with negative control group(P<0.05); ** indicated extremely significant differences with negative control group(P<0.01).图7　FGFR2蛋白相对表达量随大肠杆菌的不同作用浓度和时间的变化Fig.7　Changes of FGFR2 relative expression quantity with different concentrations of Escherichia coli at different time points

2.5大肠杆菌对奶牛乳腺上皮细胞FGFR2蛋白表达的影响从图6和图7可以看出，FGFR2蛋白表达量随着时间的延长、菌液浓度的增大而增加，105CFU/mL大肠杆菌处理组和106CFU/mL大肠杆菌处理组FGFR2蛋白表达量与阴性对照组在6 h差异极显著(P<0.01)；106CFU/mL大肠杆菌处理组和108CFU/mL大肠杆菌处理组在24 h与阴性对照组差异极显著(P<0.01)；6 h 108CFU/mL大肠杆菌处理组，12 h 106CFU/mL大肠杆菌处理组，108CFU/mL大肠杆菌处理的FGFR2蛋白表达量与阴性对照组差异显著(P<0.05)。在同一时间点，106CFU/mL大肠杆菌处理组和108CFU/mL大肠杆菌菌液处理组FGFR2蛋白表达量较高。在相同浓度下，24 h FGFR2蛋白表达量最高。

3讨论与结论

近年来的研究发现FGFs/FGFR 系统的过度激活可能导致纤维化。Inoue等[9]研究发现FGF2可作用于肌成纤维细胞，发挥其促进细胞增殖、致纤维化的作用。研究表明，FGF2 与肾间质纤维化的发生和发展可能有密切关联，它可以诱导肾小管上皮细胞出现肌成纤维细胞表型，成纤维细胞也会增生和分化成肌成纤维细胞，并过度生成 ECM，最终导致肾间质纤维化。研究发现，阻断FGF 通路可缓解肺纤维化程度[10]，并且bFGF在纤维化的肺组织、血清、肺泡灌洗液中高表达且呈正相关，说明bFGF表达增强与肺纤维化关系密切[11]。研究表明，间质及小管上皮细胞 FGF2在肾间质纤维化过程中表达上升，说明FGF2可能与肾间质纤维化相关[12]。

笔者以热灭活的大肠杆菌刺激体外培养的奶牛乳腺上皮细胞，采用qPCR、Western blot方法检测 bFGF的表达情况。结果表明，大肠杆菌显著促进了体外培养的奶牛乳腺上皮细胞中 bFGF的表达。随着大肠杆菌浓度的增加、作用时间的延长，bFGF 的表达上调，24 h bFGF表达量达到最高。该研究结果与吴建美[13]关于金黄色葡萄糖球菌对奶牛乳腺上皮细胞 bFGF 表达的趋势基本一致，与严家春等[14]研究 bFGF-mRNA在慢性乙肝肝组织中的表达相一致，与张愚等[15]关于肝硬化相关的研究结果相一致。毛小荣[16]研究表明bFGF 可直接参与肝纤维化过程，bFGF还通过对其他细胞因子的影响，间接促进纤维化的形成，如bFGF能促进 TGF 的产生，bFGF在肝组织局部为其他细胞因子发挥作用创造了条件，构成了一个局部分子反应网络。丁旭娜[17]和杨磊[18]研究表明外源性bFGF和含有bFGF的奶牛乳汁均可促进体外培养的奶牛乳腺上皮细胞bFGF的表达。该研究结果表明bFGF及其受体在大肠杆菌刺激奶牛乳腺上皮细胞中表达上调，由此可见大肠杆菌引起的奶牛乳腺纤维化过程bFGF发挥了重要作用。

bFGF 在细胞的增殖分化和ECM的过程中有重要的作用[3，5]。FGFR2为酪氨酸激酶受体，是bFGF最主要的受体，bFGF与其受体结合后可以激活细胞内的丝裂原活化蛋白激酶、细胞外信号调节激酶(MAPK/ERK)和磷脂酰肌醇-3激酶和蛋白激酶 B(PI3K/AKT)等信号通路，起到调节如血管内皮细、上皮细胞、成纤维细胞、成骨细胞和神经胶质细胞等多种起源于中胚层、神经外胚层的细胞的分化增殖，还参与机体的多种生理病理学过程(如胚胎发育、组织愈合、肿瘤的发生与转移)[19]。FGFR2表达异常，可能导致一系列疾病的发生。在乳腺癌和胃癌基因拷贝数的增加，可使FGFR2过表达而导致FGFR2信号的激活[20-21]。研究表明，FGFR2基因表达量增加，引起乳腺癌和子宫颈癌等肿瘤形成的可能性也增加。该研究结果表明热灭活的大肠杆菌能不同程度促进体外培养的奶牛乳腺上皮细胞中FGFR2的表达。然而，关于bFGF与FGFR2结合引起奶牛乳腺纤维化的信号转导通路的研究有待进一步研究。

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基金项目国家自然科学基金项目(31460642)。

作者简介于亚娟(1986- )，女，内蒙古赤峰人，硕士研究生，研究方向：动物传染病与免疫病理学研究。*通讯作者，教授，博士生导师，从事动物传染病与免疫病理学研究。

收稿日期2016-04-13

中图分类号S 852.61

文献标识码A

文章编号0517-6611(2016)15-175-04

Effects ofEscherichiacolion bFGF and FGFR2 mRNA Expression and Protein Secretion in Bovine Mammary Epithelial Cells Culturedinvitro

YU Ya-juan, WANG Feng-long*, DING Yu-lin et al

(College of Veterinary Medicine, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot, Inner Mongolia 010018)

Abstract[Objective] To explore the effects of heat-inactivated Escherichia coli on the expression of bFGF and FGFR2 mRNA and protein in vitro bovine mammary epithelial cells. [Method] The mammary epithelial cells cultured in vitro were exposed to the heat-inactivated E. coli at 105, 106 and 108 cfu/mL, respectively. The total RNA and protein were extracted from the cells after 6, 12, 24 and 48 h, respectively, for examinations by real-time RT-PCR and western blot. [Result] The bFGF mRNA expressions in all cells treated with different concentration of bacteria were significantly higher than that in control cells at every time point (P < 0.01). bFGF expression quantity was the maximum at 24 h, and then reduced. BMEC bFGF protein expression enhanced as the E. coli concentration increased, and reached the maximum value at 24 h. Except the 6 h group, FGFR2 mRNA relative expression quantity showed a trend of decrease-increase-decrease as the E. coli concentration enhanced, and reached the maximum at 48 h. Compared with control group, FGFR2 protein expression in treatment groups increased as the bacteria concentration enhanced. [Conclusion] Heat-inactivated E. coli up-regulates the expression of bFGF and FGFR2 mRNA and protein in bovine mammary epithelial cells, showing concentration and time dependence.

Key wordsbFGF; FGFR2; Escherichia coli; Bovine mammary epithelial cells