响应面法优化提取荚果蕨总黄酮的工艺研究

施伟梅,王　杨,张颖豪

(赣南医学院药学院，江西 赣州 341000)



响应面法优化提取荚果蕨总黄酮的工艺研究

施伟梅,王杨,张颖豪

(赣南医学院药学院，江西 赣州 341000)

摘要：采用响应面法优化荚果蕨总黄酮的热浸提取工艺。在单因素试验的基础上，采用响应面法考察了提取温度、提取时间、液料比和乙醇浓度对总黄酮提取率的影响，并利用Design-Expert 8.0.6软件和Box-Behnken中心组试验设计原理对各工艺参数进行了回归分析。结果表明：提取温度是对响应值影响最大的因素，最佳提取条件为提取温度73℃、提取时间158min、液料比27、乙醇浓度74%，在此条件下，荚果蕨总黄酮的提取率为1.06%，与理论值相比略有增加，相对误差为0.95%，验证了回归模型的有效性。响应面法对荚果蕨总黄酮的提取条件优化合理可行，为荚果蕨总黄酮的开发与利用提供了理论依据。

关键词：荚果蕨；总黄酮；提取；响应面分析

荚果蕨(Matteucciastruthiopteris(L.) Todaro)又名黄瓜香、广东菜，是球子蕨科荚果蕨属多年生草本植物[1]。荚果蕨富含蛋白质、多糖及多种微量元素，还有黄酮、蜕皮甾酮等天然活性成分，具药食两用的属性[2-4]。荚果蕨清香可口，质地脆嫩，已被开发成罐头制品[5]。然而，迄今为止对荚果蕨的利用主要为其嫩叶的食用，而占其大部分重量的茎和老叶却没有得到很好的利用，因此对荚果蕨资源的全面利用尚待进一步的研究和开发。目前，已有文献对荚果蕨中营养叶的黄酮成分[6]及不同采收时期的总黄酮含量[7]进行了研究，但是，其提取过程只考虑荚果蕨中的营养叶，而忽视了对全草的总黄酮的提取。本研究选用乙醇回流提取[8-9]荚果蕨中的总黄酮，在单因素实验的基础上，采用响应面法优化提取工艺，为荚果蕨的开发利用提供科学依据。

一、实验部分

(一)仪器与试剂

DHG-9070电热鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司； Lambda 35紫外可见分光光度计，美国珀金埃尔默公司；TDL-50B台式离心机,上海安亭科学仪器厂；AB135-S电子分析天平，上海树信仪表有限公司；Q-250B高速万能粉碎机，上海冰都电器有限公司。

荚果蕨：采于四川省南充市西山，将全草浸泡于蒸馏水中，晾干，在50℃烘箱中干燥至恒重后粉碎，过60目筛，置于干燥皿中密封保存备用；芦丁对照品，中国药品生物制品检定所；乙醇，分析纯，国药集团化学试剂有限公司生产，使用时，配制成不同体积浓度的乙醇溶液；其他试剂均为分析纯。

(二)试验方法

1.总黄酮标准曲线的建立

以芦丁为标准品，采用NaNO2-Al(NO3)3比色法[10]，在波长510nm处测定吸光度，以芦丁浓度X为横坐标，吸光度Y为纵坐标，绘制标准曲线，并将实验结果进行线性回归，得回归方程。

2.荚果蕨总黄酮的提取及检测

荚果蕨粉末2.000g→乙醚脱脂8h→乙醇水浴提取→趁热抽滤→定容→提取液→按1.2.1项的方法测吸光度Y，根据回归方程标准曲线，按下式计算总黄酮的提取率。

式中：b为荚果蕨提取液总黄酮的质量浓度，mg/ml；n为提取液稀释倍数；V为提取液体积，ml；W为荚果蕨粉末的质量，g。

(三)试验设计

1.单因素试验

单因素试验研究了提取温度、提取时间、液料比和乙醇浓度对荚果蕨总黄酮提取率的影响。

2.响应面试验设计

在单因素试验结果的基础上，采用Box-Behnken中心组试验法对荚果蕨总黄酮的提取工艺进行优化，确定荚果蕨总黄酮的最佳工艺条件及在此条件下的总黄酮的最大提取率。

应用Design-Expert 8.0.6软件采用Box-Behnken Design(BBD)进行试验设计。以提取温度(X1)、提取时间(X2)、液料比(X3)和乙醇浓度(X4)为自变量，荚果蕨总黄酮提取率为指标，进行响应曲面分析，因素水平设计见表1。

表1　响应曲面因素与水平表

3.验证与比较试验

通过软件分析获得最佳提取工艺条件后，按照优化条件进行提取测定，比较实验结果和方程计算值的差异。

二、结果与分析

(一)单因素试验

1.提取温度对总黄酮提取率的影响

设定乙醇浓度为80%、液料比为20、提取时间为2h的条件下，考察了不同提取温度对总黄酮提取率的影响，结果如图1所示。从图1可看出，随着温度升高，总黄酮提取率不断升高，当温度到达70℃时总黄酮提取率达到最大，继续升高温度，提取率反而下降。这是因为随着温度升高，一方面溶剂分子和黄酮类物质分子的平均动能增加，另一方面体系的粘度下降，二者共同作用，使得黄酮类物质的扩散作用增强，有利于黄酮类物质的溶出；当超出70℃之后，温度过高，乙醇汽化严重，同时温度过高，黄酮类物质会被氧化而遭到破坏[11]，从而导致总黄酮提取率的下降。因此，最佳提取温度选择为70℃。

提取温度℃提取率/%1.11.00.90.80.70.60.50.4405060708090100

图1提取温度对总黄酮提取率的影响

2.提取时间对总黄酮提取率的影响

设定提取温度为70℃、乙醇浓度为80%、液料比为20的条件下，考察了不同提取时间对总黄酮提取率的影响，结果如图2所示。从图2可看出，荚果蕨总黄酮提取率随着提取时间的增加，呈先增加后下降的趋势，当提取时间为150min时，提取率达到最高。这是因为提取时间过长时，溶出的杂质增多与黄酮类物质产生竞争，且黄酮类物质在较长时间的高温下容易被氧化而遭到降解[12]，从而导致提取率的不升反降。因此，最佳提取时间选定为150min。

提取温度℃提取率/%1.11.00.90.80.70.60.50.4405060708090100

图2提取时间对总黄酮提取率的影响

3.液料比对总黄酮提取率的影响

设定提取温度为70℃、提取时间为150min、乙醇浓度为80%的条件下，考察了不同液料比对总黄酮提取率的影响，结果如图3所示。从图3可看出，随着液料比的增加，总黄酮的溶出量逐渐增加，当液料比为25时黄酮类物质提取率达到最大值，继续增大液料比，提取率反而下降，这是因为过大的液料比，会增加浓缩成本，造成黄酮类物质的损失以及溶剂和资源的浪费[13]，因此，最佳液料比选择为25。

1.051.000.950.900.850.8010152025303540提取率/%液料比/mL?g-1

图3液料比对总黄酮提取率的影响

4.乙醇浓度对总黄酮提取率的影响

设定提取温度为70℃、提取时间为150min、液料比为25的条件下，考察了不同乙醇浓度对总黄酮提取率的影响，结果如图4所示。从图4可看出，随着乙醇浓度增加，总黄酮的提取率呈现先增后减的趋势，当乙醇浓度为70%时总黄酮提取率达到最大值。这是因为乙醇浓度过大时，亲脂性强的物质溶出随之增加[14]，干扰因素也随之加大，因此，本实验设定最佳乙醇浓度为70%。

1.051.000.950.900.850.800.750.700.650.60405060708090100乙醇浓度/%提取率/%

图4乙醇浓度对总黄酮提取率的影响

(二)响应面试验结果

1.响应面试验结果及方差分析

根据Box-Behnken的中心组合实验设计原理，选取提取温度(X1)、提取时间(X2)、液料比(X3)和乙醇浓度(X4)四个因素进行优化实验，实验因素和水平设计见表2，响应面分析方案见表3。

表2　响应曲面试验以及响应值

表3　响应曲面方差分析表

注：*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。

表4　Box-Behnken 的试验设计和实验结果

从方差分析表3可知，由试验数据所得模型的F值为13.57，P值为<0.0001，表示该模型显著。由模型拟合得到的回归方程为：Y=+1.031+0.053 6X1+0.022 5X2+0.016 9X3+0.033 7X4+0.024 0X1X2+0.028 5X1X3-0.017 2X1X4+0.023 0X2X3-5.000×10-3X2X4-2.250 0×10-3X3X4- 0.119 5X12-0.076 8X22-0.030 7X32-0.035 3X42，其方程的R2=0.931 4，表明该回归方程拟合度较好，实验误差较小。方程中P<0.05 的项代表显著项， 包括X1-提取温度、X2-提取时间、X4-乙醇浓度及二次项X12、X22、X32、X42。由此可知，各影响因素与响应值的关系并不是简单的线性关系。方程的失拟度F值为4.06，P=0.094 4>0.05，表示失拟度不显著，说明该回归方程可以较好地描述各因素与响应值之间的真实关系，调整系数为0.8627，表明有86.27%的数值可以用该模型来解释。综合上述结果可知，此回归方程可以用于对荚果蕨总黄酮的提取率进行预测分析。由此得到荚果蕨总黄酮提取率最大预测值为1.05%，最优提取工艺为：提取温度72.81℃、提取时间157.51min、液料比为27.43，乙醇浓度73.75%。

2.试验因素交互作用对响应值影响的3D分析

各因素及其相互作用对响应值的影响可以通过相应曲面3D图直观反映出来，具体结果见图5。由图5可知，并不是所有因素对荚果蕨总黄酮的提取都有显著的影响，提取温度的影响最为显著，随着提取温度的升高，总黄酮提取率随之增大，随后提取温度继续增大，总黄酮提取率则明显下降，表现为曲面较陡; 提取时间的影响次之，表现为曲面较平缓，响应值变化较小；乙醇浓度和液料比影响最小，曲面基本表现为一平直线。各具体试验因素对响应值的影响大小主次因素顺序为提取温度>提取时间>乙醇浓度>液料比。

提取率1.11.00.90.80.71801261201321381741681621561441501.11.00.90.80.7提取率6065707580提取时间/min提取温度℃807570656075706560提取温度℃乙醇浓度/%乙醇浓度/%提取时间/min提取率1.11.00.90.80.78075706560180126120132138174168162156144150提取率1.11.00.90.80.78075706560乙醇浓度/%302826222420液料比/mL?g-16065707580提取温度℃302826242220提取率1.11.00.90.80.7提取率1.11.00.90.80.7302826242220提取时间/min180126120132138174168162156144150液料比/mL?g-1液料比/mL?g-1ABCDEF

图5各因素交互作用对总黄酮得率Y影响的响应曲面(3D)

A.提取温度和提取时间对黄酮提取率的响应面图；B.提取温度和乙醇浓度对黄酮提取率的响应面图；C.提取时间和乙醇浓度对黄酮提取率的响应面图；D.液料比和乙醇浓度对黄酮提取率的响应面图；E.提取时间和液料比对黄酮提取率的响应面图；F.液料比和提取温度对黄酮提取率的响应面图

3.最佳提取工艺的优化及验证

为检验模型的可靠性，采用上述最优提取条件进行荚果蕨总黄酮的提取验证试验。考虑到实际操作的便利，将最佳工艺条件修正为：提取温度73℃、提取时间158min、液料比为27，乙醇浓度74% ，在此条件下进行3次平行试验，实际提取率为1.06%。该实验重现性良好，结果相对于预测值误差为1.03%，表明采用响应面法优化得到的提取条件参数可靠，得到的总黄酮提取条件具有实际应用价值。

三、结论

利用乙醇为溶剂提取荚果蕨总黄酮，并通过响应面分析得到了最佳提取条件，回归模型预测的荚果蕨总黄酮提取的最佳工艺条件为：提取温度73℃、提取时间158min、液料比为27，乙醇浓度74%，实际提取率为1.06%，相对于预测值相对误差为0.95%。响应面法对荚果蕨总黄酮的提取条件优化合理可行，为提高荚果蕨总黄酮的提取率提供了理论依据。

参考文献：

[1] 李姝蓓,张东,杨岚,等. 荚果蕨贯众提取物中黄酮类成分的含量测定和抗氧化活性研究[J]. 中国药学杂志,2013(21):1860-1863.

[2] DeLong J M, Hodges D M, Prange R K, et al. The influence of cold water storage on fatty acids, antioxidant content and activity, and microbial load in ostrich fern (Matteuccia struthiopteris) fiddleheads[J]. Canadian Journal of Plant Science, 2013, 93(4): 683-697.

[3] Zhang D, Li S B, Yang L, et al. Two new C-methyl flavanones from the rhizomes and frond bases of Matteuccia struthiopteris[J]. Journal of Asian natural products research, 2013, 15(11): 1163-1167.

[4] Shin S L, Lee C H. Effective Extraction of Phytoecdysteroids from Fronds of Matteuccia struthiopteris and Osmunda japonica[J]. Korean Journal of Plant Resources, 2011, 24(4): 351-357.

[5] Koenemann D M, Maisonpierre J A, Barrington D S. Broad-scale integrity and local divergence in the fiddlehead fern Matteuccia struthiopteris (L.) Todaro (Onocleaceae)[J]. American Fern Journal, 2011, 101(4): 213-230.

[6] 洪叶岚, 马骥, 肖娅萍, 等. 反相高效液相色谱法对秦岭 21 种蕨类植物中槲皮素与山奈酚含量的测定[J]. 分析测试学报, 2010, 29(3): 294-297.

[7] 刘百萍, 马骥, 张晓静, 等. 不同采收时期荚果蕨营养叶中总黄酮含量测定[J]. 食品工业科技, 2011(7): 407-409.

[8] Wong-Paz J E, Contreras-Esquivel J C, Rodríguez-Herrera R, et al. Total phenolic content, in vitro antioxidant activity and chemical composition of plant extracts from semiarid Mexican region[J]. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine, 2015, 8(2): 104-111.

[9] 陈文娟, 陈建福. 漳州血柚皮总黄酮的提取工艺研究[J]. 北京联合大学学报: 自然科学版, 2012, 26(4): 40-45.

[10] 施伟梅,杨凯,陈建福,等. 响应面法优化红花紫荆树叶中总黄酮的超声波辅助提取工艺[J]. 中国食品添加剂, 2014, 26(4):109-116.

[11] Nie K, Tang Z, Wu X, et al. Optimization of total flavonoids extraction from mulberry leaf using an ethanol-based solvent system[J]. Journal of Me-dicinal Plants Research, 2012, 6(12): 2373-2380.

[12] Jiang X, Chen Y, Shi L. Optimization of flavonoids extraction from Bombyx batryticatus using response surface methodology and evaluation of their antioxidant and anticancer activities in vitro[J]. Food Science and Biotechnology, 2013, 22(6): 1707-1715.

[13] HuiDuan L, Xu C. Extraction of flavonoids and scavenging effect on hydroxyl radicals from tamarind shells[J]. Journal of Southern Agriculture, 2014, 45(5): 844-849.

[14] TingPu W, Qiang Z, JianJun Y. Optimization of technology for extracting total flavonoids from tartary buckwheat shell by response surface methodology[J]. Journal of Food Safety and Quality, 2014, 5(6): 1629-1640.

(责任编辑夏侯国论)

收稿日期：2016-05-16

基金项目：赣南医学院科研课题(YB201429)

作者简介：施伟梅，女，赣南医学院药学院讲师。

中图分类号：R284.2

文献标识码：A

文章编号：1674-0408(2016)02-0011-06

Optimization of Extracting Flavonoids from Matteuccia Struthiopteris(L.)Todaro by Response Surface Methodology

Shi Wei-mei, Wang Yang, Zhang Ying-hao

(College of Pharmacy, Gannan Medical University, Ganzhou 341000, China)

Abstract：Response surface methodology was employed to determine optimum conditions for extraction of total flavonoids from Matteuccia struthiopteris(L.) Todaro. The temperature on extraction, extraction time, liquid-solid ratio and the concentration of ethanol were chosen to conduct the single factor experiments. And regression analysis on various process parameters was carried out according to the Design-Expert 8.0.6 software and the Box-Behnken center combination experimental principles. The results showed that the largest effect on response was the extraction temperature, and the optimum extraction condition was: extraction temperature 73℃, extraction time 158min, liquid-solid ratio 27 and the concentration of ethanol 74%, respectively. Under these conditions, the actual value was 1.06%, which had a slight increase as compared to the predicted value, and the relative error was 0.95%, indicating that the regression model fitted well with the experimental data. This study could provide a theoretical direction for extracting flavonoids from Matteuccia struthiopteris(L.) Todaro on a large scale.

Key words：Matteuccia struthiopteris(L.) Todaro; flavonoids; extraction; response surface methodology