6例心手综合征患者TBX5基因突变分析

吴爱国，张振宇，袁　红，戴　勇，汪丽霞，孙国平

(深圳市坪山新区人民医院骨科，广东 深圳 518118)



6例心手综合征患者TBX5基因突变分析

吴爱国，张振宇，袁红，戴勇，汪丽霞，孙国平*

(深圳市坪山新区人民医院骨科，广东 深圳 518118)

摘要：目的 对国内心手综合征(HOS)患者进行临床调查分析和TBX5基因突变检测，评价中国HOS患者 中TBX5基因的突变情况与临床表型的关系。方法 分别对6例来自广东省不同家系的HOS患者进行临床资料的收集；从静脉血提取HOS患者基因组DNA，通过PCR扩增和DNA直接测序法对TBX5基因进行gDNA序列突变检测，再通过生物信息学软件GENETOOL及BLAST对序列结果与Genbank标准序列进行对比，进一步分析TBX5基因突变与临床表型的关系。结果 发现3个HOS患者存在TBX5基因外显子序列突变:1个HOS患者为TBX5基因单个碱基缺失导致移码突变，2个心脏HOS患者为TBX5基因碱基替换导致错义突变。结论 TBX5基因突变可能是中国HOS患者的发病原因之一，但突变特点具有随机性，基因突变类型与临床表型未发现明显相关性。

关键词：心手综合征;TBX5基因;突变检测

心-手畸形综合征(HOS)是一种严重危害人类生命健康的常染色体显性遗传病，无明显男女发病差别，其主要临床表现为先天性心脏发育畸形如：房间隔缺损(ASD)、室间隔缺损 (VSD)、单心室及不同程度的单侧或双侧上肢发育畸形，如多指、掌骨异形等，由于遗传效应的外显性不同，HOS的临床表现也有所不同[1]。

TBX5基因属于T-box转录因子基因家族，位于染色体12q24上，有非常稳定的保守区(核苷酸847-1388)，胚胎期在心脏和上肢的发育过程中起重要作用，是目前已经证实的HOS遗传易感基因，与遗传性HOS的发生发展密切相关[2]。74%经严格诊断的家族性或散发性HOS患者发现存在TBX5基因突变，并主要发生在TBX5基因的编码外显子[2]。众多的突变(>60)导致该基因产生了错误的TBX5转录因子氨基酸序列或出现临终的终止密码子，引起该基因编码的蛋白质错误或合成提前终止，导致编码的蛋白质功能丧失，进一步引起心脏的发育异常和上肢的畸形[2，3]。

目前中国人群TBX5基因突变检测较少,我们对6个家族性HOS患者通过DNA基因组测序方法进行突变位点检测,探讨TBX5基因突变与心手综合征的关系。

1资料与方法

1.1一般资料本研究选取2005年到2015年确诊为HOS患者6例，所有患者均已行染色体核型分析排除染色体病，以临床检查、骨骼影像学检查及超声心动图等方法收集HOS患者临床资料。上述病人来自6个不同家庭，男4 人，女2 人，年龄9岁半至64 岁。

1.2检测方法

1.2.1HOS患者DNA组抽提在医院伦理委员委员会、患者本人及直属家属同意的前提下，抽取患者外周血5mL,枸橼酸钠抗凝，DNA 提取试剂盒(Qiagen公司)提取基因组DNA，并存放于-20℃冰箱中备用。

1.2.2TBX5引物合成和PCR扩增人类TBX5 基因(Genbank编号：NG-007373.1)全序列从Genbank数据库(NCBI;http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中获取，应用引物设计软件primer5.0设计TBX5基因各外显子序列的引物，引物合成由广州锐博公司完成,然后进行TBX5基因各外显子gDNA序列的扩增。

1.2.3TBX5 gDNA序列纯化并测序应用PCR产物纯化试剂盒(SunShinecleanTM) 对PCR产物进行纯化回收,应用Applied Biosystem 377型全自动荧光序列分析仪对纯化产物进行DNA测序。

1.3序列数据分析TBX5基因标准核酸序列位置从美国Genbank网站上获取，应用生物信息学软件GENETOOL及BLAST等将所得6例HOS患者TBX5序列与标准序列与标准序列进行对比分析，以确定病例是否携带该基因突变，并与国内外文献报道对比所检测到的突变位点，确定是否存在新的突变位点，见表1。

表1　TBX5各外显子引物序列

2结果

患者心脏-肢体畸形表型见表2。我们的研究发现，HOS患者1、3及4 在TBX5基因序列上存在突变位点，HOS患者1 TBX5基因在cDNA序列1294位上的T缺失,与Genbank数据库上现存TBX突变位点对比，此突变位点国内外尚无报道,为新发现的突变位点;HOS患者3 TBX5基因第7个外显子处c.668C>T突变;先证者(家庭遗传性疾病中第一个被确诊者)4 TBX5基因第7个外显子处c.710G>A突变;先证者2、5及6未检测到TBX5基因突变位点。

表2　HOS家系临床表型及TBX5基因突变情况

3讨论

T-box基因家族，包括TBX5基因，对胚胎的发生发育至关重要。TBX5与其他心脏发育转录因子，包括GATA4和NKX2-5共同作用转录激活心脏及上肢发育相关基因[4]。TBX5基因也被证明是正常心脏传导系统的所必需因子之一[5]。本研究对6例广东省内HOS患者进行基因突变检测，其中3例存在TBX5核酸序列上的基因突变，分别引起了ASD/ⅠAVB、VSD和VSD/PDA。另外，由于HOS患者1目前尚年轻(9岁)，未来可能会出现更严重的房室传导阻滞。然而，6例HOS患者上肢畸形相对较轻，并没有出现斜肩及海豹肢症等，验证了TBX5基因突变可能与HOS的发生密切相关。值得一提的是，我们发现的3种TBX5 基因突变位点中，有一种TBX5 基因致病突变位点(c.1294delT)是第一次发现，未在国内外研究或Genbank等数据库中查到，这可能是广东省人群特异性突变位点，有必要做进一步的大量研究数据验证。

然而，另外3个HOS家系中没有找到TBX5基因突变，但这些患者同样出现了HOS的表型及遗传特征，可能的原因有:①HOS的发生发展并不单纯由TBX5基因序列突变引起，还可能存在其他的基因异常影响心脏和上肢的发育，如Homeobox 基因、肽成长因子、骨形态发生蛋白(BMP)及其他影响心脏及上肢发育的编码基因等。②该家系患病成员在基因转录或者翻译水平出现异常，导致心脏和上肢发育畸形,进而导致HOS的症状，但这种假设仍需在转录和翻译水平进一步加以研究证实。

我们的研究发现HOS患者3上肢骨骼结构和心脏发育的异常类似于文献中报道的一个c.668C>T错义突变患者[6]，但HOS患者4却与文献报道[7]患者出现了不同的临床表型。相同的TBX5基因突变位点，却出现了不同的严重程度的临床表型，分析可能的原因有:①存在其他影响心脏和上肢发育的突变加重或减轻TBX5位点突变的效应；②TBX5基因突变患者可能为嵌合体，临床表型的取决于基因突变的不同发育阶段；③还有其它不同修饰基因作用所导致的综合效应。因此，有必要通过生物材料或分子模型等进一步研究相同或不同位点突变所导致的TBX5蛋白功能改变。

总之，本研究对HOS患者病例进行了TBX5基因突变的检测，发现TBX5基因突变可能是HOS发生发展的潜在病因，HOS临床表型的严重程度似乎依赖于TBX5基因突变的位点及其他遗传因子的综合效应。

参考文献：

[1]Tidake A，Gangurde P，Shaikh Z，et al.Tetralogy of Fallot with Holt-Oram syndrome:case report and review[J].Clin Res Cardiol,2015,104(9):790

[2]Ghosh TK，Packham EA，Bonser AJ，et al.Characterization of the TBX5 binding site and analysis of mutations that cause Holt-Oram syndrome[J].Hum Mol Genet,2001,10(18):1983

[3]杨进福，胡冬煦，夏家辉，等.TBX5基因在中国人心手综合征患者中的突变分析[J].中华医学遗传学杂志,2000，17(4):12

[4]Hiroi Y，Kudoh S，Monzen K，et al.Tbx5 associates with Nkx2-5 and synergistically promotes cardiomyocyte differentiation[J].Nat Genet,2001,28(3):276

[5]He J，Mcdermott DA，Song Y，et al.Preimplantation genetic diagnosis of human congenital heart malformation and Holt-Oram syndrome[J].Am J Med Genet A,2004,126A(1):93

[6]Brassington AM，Sung SS，Toydemir RM，et al.Expressivity of Holt-Oram syndrome is not predicted by TBX5 genotype[J].Am J Hum Genet,2003,73(1):74

[7]Basson CT，Bachinsky DR，Lin RC，et al.Mutations in human TBX5[corrected]cause limb and cardiac malformation in Holt-Oram syndrome[J].Nat Genet,1997,15(1):30

*通讯作者，E-mail:512875650@qq.com

中图分类号：R541

文献标识码：B

文章编号：2095-4646(2016)03-0214-03

DOI:10.16751/j.cnki.2095-4646.2016.03.0214

(收稿日期：2016-01-26)