多发性骨髓瘤免疫表型特征及其临床意义

张翠萍，汪鹏，李庆，徐修才，胡超杰，郑南

( 安徽医科大学附属省立医院、安徽省立医院，a 中心实验室，b 肾脏内科，合肥230001)



·论著·

多发性骨髓瘤免疫表型特征及其临床意义

张翠萍a，汪鹏b，李庆a，徐修才a，胡超杰a，郑南a

( 安徽医科大学附属省立医院、安徽省立医院，a 中心实验室，b 肾脏内科，合肥230001)

[摘要]目的探讨流式细胞术检测多发性骨髓瘤(MM)的免疫表型特征及其临床意义。方法应用多参数流式细胞术(MP-FCM)，采用CD138/CD45/SSC设门，检测40例MM患者和20例正常献髓者骨髓细胞免疫表型。结果MM患者抗原异常表达率由高到低分别为CD45dim+/-(95%)、CD81dim+/-(80%)、CD56+(70%)、CD27dim+/-(50%)、CD200++(48%)、CD33+(40%)、CD28++(35%)、CD117+(18%)、CD19+(5%)和CD20+(3%)。CD56+、CD200dim+、CD28dim+在正常浆细胞的表达率分别为10%、10%和5%。结论应用MP-FCM检测MM细胞免疫表型,可准确地鉴别良恶性浆细胞，有助于MM的诊断、预后判断及靶向治疗。

[关键词]多发性骨髓瘤；免疫表型分型; 浆细胞；流式细胞术

多发性骨髓瘤(MM)是骨髓内单一浆细胞株异常增生，并伴单克隆免疫球蛋白增多和溶骨性病变为特征的一种恶性肿瘤。多发于中老年人，临床表现多样。由于骨髓病变呈灶性分布，浆细胞达不到诊断标准，或为不分泌型，且部分骨髓瘤细胞和反应性增多的浆细胞与正常浆细胞在形态上难以区别，因此诊断较为困难。近年来，多参数流式细胞术(MP-FCM)在MM诊断、治疗和疗效观察等方面的价值日益突出。国内一般通过四色免疫荧光MP-FCM测定MM患者骨髓细胞的免疫表型，本实验室采用八色流式细胞术分析其免疫表型特点，为临床明确诊断和预后判断提供重要的实验依据。

1材料和方法

1.1病例资料收集安徽省立医院2013-2015年住院的40例初诊MM患者，均符合《血液病诊断及疗效标准》第2版诊断标准[1]。其中男27例，女13例；年龄32～77岁，中位年龄60.5岁；免疫球蛋白类型IgG型22例，IgA型11例，IgD型2例，轻链型5例；按照Durie-Salmon分期诊断标准I期1例，Ⅱ期10例，Ⅲ期29例。20例健康对照组均为志愿献髓者，男12例，女8例，年龄21～48岁，中位年龄34岁。

1.2主要仪器和主要试剂流式细胞仪为美国Becton Dickinson公司的FACS Canto Ⅱ型。荧光标记鼠抗人单克隆抗体包括CD138、CD38、CD19、CD56、CD81、CD22、CD20、CD27、CD117、CD28、CD33、CD34、CD200、CD45，以及各自对应的同型阴性对照试剂，红细胞裂解液，破膜剂均购自美国Becton Dickinson公司，抗Kappa-FITC /Lambda -PE组合抗体(克隆号FR481)购自丹麦DAKO公司。

1.3检测方法EDTA抗凝的新鲜骨髓液送检后于4 h内按八色免疫荧光直接标记方法，分别进行细胞膜表面和胞浆内染色。染色前用PBS洗2次，去除亲细胞抗体。处理后的标本在2 h内上机检测，用BD FACS Diva软件获取500 000个细胞，对数取样。正确的设门策略是分析浆细胞表型的关键。本实验采用CD138/CD45/SSC联合设门，圈出CD45+或CD45dim+/-CD138+细胞群(P2)，分析该群细胞(P2)的抗原表达情况,见图1。流式细胞术检测结果以荧光强度<102为阴性(-)，102～103范围内为弱阳性(dim+)，103～ 104范围内为阳性(+)，大于104为强阳性(++)。抗原表达>20%确定为抗原阳性。

2结果

2.1骨髓中浆细胞比例MM患者骨髓标本采用CD138/CD45/SSC设门后，可见CD45dim+/-CD138+区域有一群异常细胞，该群细胞占全部有核细胞的比例在3.5%～88.9%(中位值为17.55%)。同时送检的骨髓涂片中原幼稚浆细胞的比例在1.5%～77.5%(中位值为16.5%)。20例正常对照骨髓，CD45+/ CD138+区域有微量细胞群，该细胞占全部有核细胞的比例在0.01%～0.42%(中位值为0.18%)。

2.2MM患者异常浆细胞免疫表型利用MP-FCM同时检测胞膜抗原CD38、CD138、CD45、CD19、CD56、CD81、CD200、CD27、CD28、CD117、CD20、CD33，以及胞膜和胞浆免疫球蛋白轻链(kappa/Lambda)的表达情况，可见多项抗原表达异常。MM中抗原异常表达率由高到低分别为CD45dim+/-(95%)、CD81dim+/-(80%)、CD56+(70%)、CD27dim+/-(50%)、CD200++(48%)、CD33+(40%)、CD28++(35%)、CD117+(18%)、CD19+(5%)和CD20+(3%)；限制性表达胞浆轻链，其中Kappa轻链型占55%，Lambda轻链型占45%。所有异常浆细胞均高表达CD138++和CD38+，均不表达胞膜Kappa和胞膜Lambda。见表1。

2.3健康对照组浆细胞免疫表型健康对照组浆细胞均表达CD38++、CD138+、CD19+、CD81+、CD27++和CD45+，不表达CD117、CD33、CD20、胞膜Kappa和胞膜Lambda；多克隆性表达胞浆轻链Kappa和Lambda。20例正常骨髓中有2例(10%)表达CD56+，2例(10%)弱表达CD200dim+，1例(5%)弱表达CD28dim+。见表1。

表1　正常浆细胞和异常浆细胞免疫表型特点

3讨论

近年来，随着对MM认识的深入，多参数流式细胞术检测骨髓瘤细胞免疫表型特征成为MM诊断和预后判断的重要依据[2]。流式细胞术分析骨髓瘤细胞免疫表型时，合理的设门策略是提高敏感性和可重复性的关键。根据2008年欧洲骨髓瘤工作组(EMN)[3]的推荐，为了准确定量和富集骨髓瘤细胞，至少要有一个管抗体组合，将CD38、CD138、CD45包括在内；初始设门应该包括CD38++和CD138+共表达。本研究采用CD138/CD45/SSC联合设门，每管均包括CD138和CD45两种抗体，其中有一管包括CD38、CD138和CD45三种抗体，与EMN的要求一致，分析时首先使用CD38/CD138表达而不是CD138/CD45设门，可确保不遗漏CD45+浆细胞；同时选择多项细胞膜表面和胞浆抗原来区别正常与异常浆细胞。与国内相关研究比较，本研究具有设门方案更精确，检测抗原谱更广，参数更多的特点。

本研究对MM患者和正常骨髓进行了胞浆Kappa及Lambda的检测，采用EMN推荐的检测组合(cykappa/Lambda/CD19/CD38/CD138/CD45)，可以同时分析CD38++CD138+CD19-和CD38++CD138+CD19+两类细胞的轻链克隆性，提高了检测的灵敏度。结果显示，MM患者异常浆细胞的胞浆免疫球蛋白轻链均存在单克隆限制性表达，而正常浆细胞均呈多克隆表达。异常浆细胞典型的免疫表型为CD38++、CD138+、CD19-、CD56+、CD117+、CD45dim+/-、CD20+[3]。虽然绝大部分正常浆细胞表型是CD19+CD56-CD45+，然而可以检测到少量正常浆细胞免疫表型与异常浆细胞相似。国外学者[4-6]报道正常骨髓中有20%～40%的正常浆细胞不表达CD19，10%～47%的正常浆细胞表达CD56。在正常献髓者骨髓中可以检测到浆细胞CD45弱表达(dim)[5]，CD45的表达随着浆细胞分化过程逐渐下降[7-8]。少量正常浆细胞CD19-CD56+CD45dim+的表达可能导致异常浆细胞百分比的错误计算[6]。Tembhare等[9]报道CD19、CD56和CD45抗原鉴别正常浆细胞和异常浆细胞特异性低，特异性分别为50%、74%、59%；CD20虽然有高的特异性(91%)，但是敏感度只有34%；CD81联合以上抗原检测特异性和敏感度均可以达到100%。

本研究结果表明，40例MM患者全部表达CD38++、 CD138+，有38例(95%)CD45弱阳性表达或阴性，有28例(70%)CD56阳性表达，2例(5%)CD19阳性表达；20例正常组骨髓全部表达CD19+和CD45+，有2例(10%)表达CD56+。CD81在正常浆细胞上全部表达，但是在异常浆细胞上弱表达或阴性，是区别正常浆细胞和异常浆细胞的有效诊断指标[10]。本研究显示40例MM病例有16例CD81弱阳性表达或阴性，较Tembhare等[9]报道的比值偏低，而健康对照组无一例CD81弱阳性表达或阴性。CD81是鉴别良恶性浆细胞的重要标志之一，并且可能与MM发病机制密切相关，可以作为骨髓瘤的一种新的恶性预后指标[11]。CD200也是鉴别良恶性浆细胞的有效诊断指标之一，在正常浆细胞上弱表达，而在异常浆细胞上强表达。本研究显示MM组有19例(48%)强表达CD200++，比Aref等[12]报道的比例低，而健康对照组有2例(10%)弱表达CD200dim+。CD200异常表达与疾病进展密切相关，是预后不好的因素[13-14]。目前国内尚无关于CD81和CD200在MM患者中检测和应用的报道。本研究将CD81和CD200作为MM病例常规检查指标，提高了诊断率和准确度。多项研究[15-21]表明，基本的检测组合包括CD19和CD56可以覆盖至少90%的MM患者，联合CD20、CD117、CD28和CD27抗原可以增加到95%以上的患者。本组40例MM患者骨髓中恶性浆细胞诊断效率达到100%。

多项研究表明，CD19+、CD56+、CD117+、CD20+、CD27dim+/-、CD28++、CD33+等抗原表达异常与MM患者的预后密切相关，是预后不好的因素[3,22-24]。有研究报道CD117抗原表达与酪氨酸激酶的活化有相关性，如果患者CD117抗原表达阳性率高，可以提示临床采用酪氨酸激酶抑制剂治疗[25]。CD20阳性MM患者是否对利妥昔单抗有效，目前报道不一致。有研究[26]报道，疗效与患者CD20阳性细胞的比例有关。

总之，利用MP-FCM同时检测胞膜CD38、CD138、CD45、CD19、CD56、CD81、CD200、CD27、CD28、CD117、CD20和CD33多项抗原，及胞膜和胞浆免疫球蛋白轻链(kappa/Lambda)的表达情况,可以区分良恶性浆细胞，在MM的诊断与鉴别诊断，预后判断，靶向治疗等方面有着重要的价值。

(本文图1见封三)

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基金项目:国家自然科学基金面上项目(81472018)；安徽省自然科学基金面上项目(1408085MH145)

作者简介：张翠萍，主管技师，Email:794609084@qq.com

中图分类号:R733.3

文献标识码:A

DOI:10.3969/J.issn.1672-6790.2016.03.002

(收稿日期：2015-10-08)

Immunophenotype and its clinical significant of multiple myeloma

ZhangCuiping*,WangPeng,LiQing,XuXiucai,HuChaojie,ZhengNan

(*CentralLaboratoryofMedicalResearchCenter,AffiliatedProvincialHospitalofAnhuiMedicalUniverstiy,Hefei230001,China)

[Abstract]ObjectiveTo explore the immunophenotype and its clinical significant of Multiple Myeloma(MM). MethodsThe immunophenotype of 40 patients with MM and 20 normal volunteers were detected by multiparameter flow cytometry(MP-FCM). ResultsThe abnormality expression of antigens sequence of patients with MM was CD45dim+/-(95%),CD81dim+/-(80%),CD56+(70%),CD27dim+/-(50%),CD200++(48%),CD33+(40%),CD28++(35%),CD117+(18%),CD19+(5%),CD20+(3%) in order. However the positive rations of CD56+, CD200dim+and CD28dim+were 10%, 10%and 5%, respectively. ConclusionMP-FCM inspections can accurately discriminate the benign and malignant plasma cell,and provide evidence for prognosis evaluation and targeted therapy.

[Key words]Multiple myeloma ; Immunophenotyping; Plasma Cells ; Flow cytometry