2012—2014年我国鸡传染性支气管炎分子流行病学调查

宋新宇，刘兆霞，窦小龙，郭莉莉，马 爽，范根成（青岛易邦生物工程有限公司，山东青岛 266114）



2012
—2014年我国鸡传染性支气管炎分子流行病学调查

宋新宇，刘兆霞，窦小龙，郭莉莉，马 爽，范根成
（青岛易邦生物工程有限公司，山东青岛 266114）

摘 要：为了解近年来我国鸡传染性支气管炎病毒的主要类型，2012—2014年，从华东、华北和华中等地区出现传染性支气管炎（IB）的养鸡场中，采集病料进行病毒分离。从中分离鉴定出IBV流行株69株。对所有分离株进行S1基因扩增、测序和遗传进化分析。结果显示毒株共包含6个基因型，根据各基因型中包含的毒株数量多少依次为：QX型（54株，占78.26%）、Mass型（6株，占8.7%）、4/91型（3株，占4.35%）、TW-I型（2株，占2.90%）、tl/CH/LDT3/03型（2株，占2.90%）和CK/CH/LSC/99I型（2株，占2.90%）。将GenBank中收录的所有2012—2014年间国内分离株S1基因序列下载并构建遗传进化树，结果表明QX型IBV已成为当前国内流行的绝对优势基因型。

关键词：流行病学调查；鸡传染性支气管炎病毒；同源性比对；一致；QX型

鸡传染性支气管炎（IB）是由冠状病毒科的鸡传染性支气管病毒（IBV）引起的鸡的一种传染病，根据其临床表现及剖检病变不同，可分为呼吸型、生殖型、肾型等多种类型，死亡率为10%～50%。此病不仅可以导致育雏及育成期的鸡发病，而且也可导致产蛋期的鸡不同程度地发病。从病死鸡的腺胃、气管和肾脏中可分离到IBV。

IBV在自然界更换宿主的过程中不断发生变异。20世纪30到40年代，IBV主要侵害呼吸和生殖器官，60年代陆续有肾型的发生与流行，90年代嗜胃肠道毒株开始出现并给养鸡业造成严重损失［1］。

近年来，由于IB疫苗大量使用所带来的免疫压力，国内流行的IBV毒株处于持续不断地进化当中。近几年主要使用的Mass型、LDT3-A型和4/91型等疫苗，对当前流行株的交叉保护效果并不理想。鉴于目前免疫压力的存在，故开展此次调查，并从分子生物学方面进行研究分析。

1　材料

1.1SPF种蛋

购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。

1.2病料

从华东、华北、华中、华南、西北和东北等地区出现IB病变的养鸡场（户），采集病（死）鸡腺胃、气管和肾脏。

1.3引物

参照GenBank收录的IBV S1基因序列保守区域设计，由上海invitrogen公司合成。如下所示：

上游引物IBV-87：5'-TAT TGA TTA GAG ATG TTG GG-3'；

下游引物S1 Oligo3'：5'-CAT AAC TAA CAT AAG GGC AA-3'。

1.4酶类和主要试剂

反转录酶（M-MLV）购自大连宝生物工程有限公司；Phusion®超保真DNA聚合酶购自美国New England Biolabs公司；RNA提取试剂盒、PCR 产物凝胶回收试剂盒均为天根生化科技（北京）有限公司产品。

2　流行病学调查及方法

2.1流行病学调查

2012—2014年，从华东、华北、华中、华南、西北和东北等地区出现传IB病变的养鸡场（户），采集病（死）鸡腺胃、气管和肾脏。发病鸡主要表现为精神沉郁，羽毛蓬松，两翅下垂，排白色或水样稀便，有不同程度的呼吸道症状，渐进性消瘦。剖检病死鸡可见气管有不同程度的出血，气管内黏液增多；肾脏明显肿胀，有大量尿酸盐沉积（呈花斑肾）；部分鸡输尿管扩张，充满白色尿酸盐；直肠后段及泄殖腔可见较多尿酸盐沉积；个别鸡腺胃肿胀。病死鸡严重脱水，消瘦，皮下肌肉干燥。这些发病鸡场均免疫了IB疫苗。

2.2病毒分离与鉴定

将无菌采集的样品用灭菌生理盐水匀浆制成20%悬液，3 000 r/min离心15 min，取上清除菌后，经尿囊腔分别接种10日龄SPF鸡胚，孵化144 h，收集尿囊液并进行HA测定，同时观察鸡胚的变化。一般每份样品需要连续盲传3～5代，对出现IB典型病变的鸡胚，收获尿囊液进行进一步鉴定。

2.3分子生物学鉴定

取采集到的疑似IB病料，根据GenBank中收录的IBV S1基因序列设计引物，进行S1基因的RT-PCR扩增，序列测定。

2.4序列比较分析

用MEGA5.05软件进行序列比较和分析。

3　结果

3.1流行病学调查结果

3.1.1基本情况。 2012—2014年，先后在华东、华北、华中、华南、西北和东北等地区调查了106个发病鸡场。通过对发病鸡场进行调查、采集病料进行病毒分离和鉴定及相关研究，共分离到69株IBV。毒株分离时间及数量地域分布情况见表1。

表1　IBV毒株分离时间及数量地域分布

3.1.2发病特点

3.1.2.1易感动物。肉用型鸡在3～5周龄最易发病。蛋用型鸡在育雏期35周龄和产蛋期的25～30周龄较易发病。肉用型鸡比蛋用型鸡易感，在肉用型鸡中，白羽肉鸡的IBV检出率占70%，其他品种占12%，说明白羽肉鸡比我国地方品种易感。

3.1.2.2发病情况。肉用型鸡IB发病率高达82%，蛋用型发病率为18%。蛋鸡/黄/麻鸡的死亡率为3%～15%，白羽肉鸡死亡率可达到30%。

3.1.2.3传播途径。主要通过空气和病鸡的粪便、排泄物传播。雏鸡（被IBV污染的鸡）运输是本病暴发和流行的一个重要传播途径。

3.1.2.4临床症状与剖检病理变化。发病早期，鸡群先出现精神不振，严重时沉郁，羽毛松乱，伴有呼吸道症状，喘气、呼噜、咳嗽，肿眼流泪，严重的单侧或双侧失明，中期出现拉黄绿色、黄白色稀便，采食减少，饮水可能增多，鸡逐渐消瘦，生长缓慢或停止，最后衰竭死亡。剖检病变主要表现为气管环黏膜充血、出血，表面有浆液性或干酪性分泌物，部分病死鸡可见腺胃轻度肿胀、粘膜扁平、乳头不清 ；大部分病死鸡剖检可见明显的肾脏肿大、花斑肾。

3.2病原的分离及鉴定

从华东、华北、华中、华南、西北和东北地区发病鸡群中无菌采集气管、肾脏和腺胃，制备20%的乳悬液，接种10日龄SPF鸡胚，每胚尿囊腔接种0.2 mL，37℃孵化144 h，收集尿囊液并进行HA测定，同时观察鸡胚的变化。连续盲传3～5代，各代尿囊液HA效价呈阴性，接种后部分鸡胚出现早期死亡。死亡鸡胚全身出血明显，未死鸡胚发育受阻，呈明显的侏儒胚、蜷缩胚变化。

3.3分子生物学鉴定

各流行株的S1基因扩增情况比较稳定。扩增结果经1%琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯下观察，可见一条清晰的1.7 kb左右大小的条带，与引物设计的预期结果相符。各毒株序列测定结果分析表明，所得序列均为IBV S1基因，被扩增出的片段中均含有编码S1蛋白的完整阅读框架。

3.4IBV同源性比对分析

图1　2012—2014年IBV分离株及部分经典疫苗株S1基因遗传进化树

3.4.1各地分离株与部分IBV经典疫苗株的序列比较分析。对2012—2014年间分离的IBV流行毒株69株，用MEGA5.05软件进行序列比较和分析，遗传进化分析结果显示毒株共包含6个基因型，根据各基因型中包含的毒株数量多少依次为：QX型（54株，占78.26%）、Mass型（6株，占8.7%）、4/91型（3株，占4.35%）、tl/CH/LDT3/03型（2株，占2.90%）、TW-I型（2株，占2.90%）和CK/CH/LSC/99I型（2株，占2.90%）。遗传进化树见图1。

3.4.2GenBank收录国内IBV分离株S1基因遗传进化分析结果。共从GenBank中下载获得2012—2014年间国内IBV流行毒株S1基因序列437条，遗传进化分析结果显示其共包含10个基因型，根据各基因型中包含的毒株数量多少依次为：QX型（328株，占75.06%）、Mass型（22株，占5.03%）、CK/CH/LSC/99I型（19株，占4.35%）、HN-08型（18株，占4.12%）、4/91型（17株，占3.89%）、TW-I型（12株，占2.75%）、CH-VI型（8株，占1.83%）、tl/CH/LDT3/03型（7株，占1.60%）和TW-II型（5株，占1.14%），另外还有不能归入任何已知范畴的基因型（1株，占0.23%）。结果见图2。

图2　2012—2014年GenBank收录IBV国内分离株S1基因遗传进化树

4　讨论

自1930年首次在美国北达科他州发现IB以来，几乎所有养鸡国家均发现有该病流行。我国于1978年由邝荣禄首次报道在广东分离到IBV［2］。流行的IBV血清型/基因型呈典型的地域性分布。近年来随着交通运输的日益发达和动物及动物产品国际贸易的日益频繁，部分基因型IBV毒株开始出现跨国家和地区传播与流行的态势［3］。

目前，疫苗免疫仍是控制IB最常用、最有效的措施，最常用的是Mass型疫苗。该型疫苗也是目前在世界范围内使用最广泛的疫苗，常用的毒株H120、H52、Ma5、W93、28/86和M41在基因型上均属于Mass型，其中H120和H52在很多国家均有应用，被认为对多种血清型的毒株均能提供交叉免疫保护。但在出现新IBV基因型毒株流行的情况下，需要及时研制与该基因型一致的新型疫苗并在生产中与常规疫苗配合使用，才能取得较好的免疫保护效果。在美国，Mass型、Conn型和Ark型的疫苗使用范围最广，而其他型（如DE072）只是地区性使用［3］。在一些欧洲国家，除了H120株外，还接种D274、D1466和4/91（793/B）等疫苗株。在澳大利亚，则使用他们自己的B亚型和C亚型IBV疫苗。在韩国，除了H120株外，还接种K2株（KM91型）［3］。目前在我国应用的疫苗，除H120株和H52株以外，还有W93、28/86、Ma5等毒株，均属于Mass型［4］；2011年农业部批准了一个新的活疫苗LDT3-A株，属于LDT3-A型；虽然有报道认为4/91疫苗对流行毒株保护效果优于传统的Mass型疫苗，但目前该疫苗在国内未获得官方批准。

大量的流行病学监测结果显示，由于IB疫苗大量使用所带来的免疫压力，在国内流行的IBV毒株正处于持续不断地进化当中。QX型（也称LX4型）为最主要的基因型（54.1%）［5］。根据最近的研究报道，在2009年以后的国内分离株中，QX型毒株所占的比重至少在65%以上［6-14］。根据本研究对2012—2014年期间国内IBV的流行病学调查结果，QX型毒株已经成为国内主要流行基因型，并且仍有进一步扩大的趋势。根据文献报道，现有疫苗对QX型毒株交叉免疫保护性较低［15］，因此研制对QX型交叉保护性好的疫苗日益迫切。

参考文献：

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（责任编辑：朱迪国）

中图分类号：S851.3

文献标识码：B

文章编号：1005-944X（2016）01-0013-05

通讯作者：范根成

Epidemiological Survey on Avian Infectious Bronchitis in China from 2012 to 2014

Song Xinyu，Liu Zhaoxia，Dou Xiaolong，Guo Lili，Ma Shuang，Fan Gencheng
（Qingdao Yebio Biological Engineering Co.，Ltd，Qingdao，Shandong 266114）

Abstract：In order to investigate the epidemiology of the avian infectious bronchitis （IB）strains in China，the infected samples of sick/dead chickens in suspected IB farms were collected from various provinces in the east，north and central area of China from 2012 to 2014. By virus isolation test，69 IB isolates were identifi ed. The S1 gene of all isolates were sequenced and conducted by the phylogenetic analysis.The results showed that there were six genotypes：QX genotype （54 isolates，78.26%），Mass genotype（6 isolates，8.7%），4/91 genotype（3 isolates，4.35%），TW-I genotype（2 isolates，2.90%），t1/CH/LDT3/03 genotype（2 isolates，2.90%）and CK/CH/LSC/99I genotype（2 isolates，2.90%）.All S1 gene sequences of IB isolates in China from GenBank from 2012 to 2014 were downloaded，and the phylogenetic tree was built up. The results of this study proved that IBV QX genotype was predominant in China.

Key words：epidemiological investigation；avian infectious bronchitis virus；homology comparison；consistency；QX type