奶牛疣状毛癣菌的分离鉴定及其耐药性分析

王建昌，姜彦芬，王 珅，王金凤（河北出入境检验检疫局检验检疫技术中心，河北石家庄 050051）



奶牛疣状毛癣菌的分离鉴定及其耐药性分析

王建昌，姜彦芬，王 珅，王金凤
（河北出入境检验检疫局检验检疫技术中心，河北石家庄 050051）

摘 要：为了解奶牛皮肤真菌病的病原及其对常见抗真菌药物的敏感性，给临床治疗提供依据，从具有皮肤真菌病症状奶牛病灶处的皮屑样品中，使用沙氏培养基分离病原真菌，通过核糖体rDNA ITS序列对其分析鉴定。使用ATB FUNGUS 3真菌药敏试纸条测定5-氟胞嘧啶、两性霉素B、氟康唑、伊曲康唑及伏立康唑对所分离病原真菌的最低抑菌浓度（MIC）。结果表明，在沙氏培养基上分离到的10株中心蜡状成堆、边缘“杉树状”的真菌，经ITS序列分析，鉴定为人兽共患性致病真菌——疣状毛癣菌；所分离的疣状毛癣菌对伏立康唑、伊曲康唑均为敏感，对氟康唑均为中介，而对两性霉素 B及 5氟胞嘧啶均为耐药；ITS序列分析可实现对真菌的快速、准确鉴定；伏立康唑、伊曲康唑对本研究中分离的疣状毛癣菌具有良好的体外抗菌活性。

关键词：皮肤真菌病；疣状毛癣菌；ITS序列；耐药性；人兽共患；分离鉴定

动物皮肤真菌病（Dermatophytosis），又称为皮癣（Tinea）或癣病（Ringworm），是一种人兽共患病，主要是由毛癣菌、小孢子菌和表皮癣菌属等多种皮肤真菌引起毛发和皮肤角质层的感染。牛癣病主要是由疣状毛癣菌（Trichophyton verrucosum）引起的一种高度传染性皮肤病［1-2］，多见于头部、颈部和躯干侧面，呈现直径为10～50 mm的环状区，被毛脱落，初期为红色，结痂后呈现灰色，同周围界限明显［3］。牛癣病在世界范围内广泛存在。在意大利中部20个农场的294头牛中，100%农场存在癣病感染，87.7%的牛可分离出疣状毛癣菌［2］。癣病在日本牛群中也广泛存在，疣状毛癣菌的分离率为58.6%［4］。德国Kielstein等从14个牛群中分离到27株疣状毛癣菌［5］。疣状毛癣菌在伊朗中牛群的分离率为31.8%，是反刍动物癣病的主要

目前随着真菌感染率逐渐增高，大量新型抗真菌药物不断涌现，因此临床耐药菌株的出现，以及抗真菌药物合理有效的使用已越来越被人们重视。评价抗真菌药物敏感性的最基本方法之一是测定其最低抑菌浓度（MIC值）。抗真菌药物的药敏试验方法一般分为液体培养基稀释法（常量法和微量法）、琼脂培养基法（琼脂稀释法和琼脂扩散法）以及由此改进的E-test法和药敏纸片法，还有比色法、流式细胞仪法、葡萄糖消耗法等其他方法。

疣状毛癣菌是一种人兽共患性真菌，可以引起人的感染［10］。在伊朗［7］、中国［8］、美国［11-12］、加拿大［13］、澳大利亚［14］等国家均有因接触癣病发病牛而导致人感染的病例，其具有明显的职业性和十分重要的公共卫生学意义。本研究通过分析疣状毛癣菌的核糖体内部转录间隔区（ITS）核苷酸序列，准确鉴定了10株临床分离的疣状毛癣菌，并使用法国梅里埃ATB FUNGUS 3真菌药敏试剂条测定其最小抑菌浓度MIC值（mg/L），为研究真菌感染情况，开展有效临床治疗，预防从业者感染提供科学依据。

1　材料与方法

1.1病料来源

病料均来自河北2013—2014年具有不同程度皮肤真菌病症状的奶牛，共计34份。使用酒精棉球擦拭病灶的病健交界处，清除皮肤表面污垢，然后用手术刀片与皮肤呈45度角顺毛轻轻刮取毛发、皮肤至灭菌的25%甘油中，直至轻微出血。取样完毕后用碘酒处理取样部位以防继发感染。

1.2主要试剂与设备

沙氏培养基、氯霉素、放线菌酮、乳酸酚棉蓝染色液均购自青岛海博生物技术有限公司；ATB FUNGUS 3真菌药敏试剂条购自生物梅里埃中国有限公司；Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司；pMD 19-T Simple Vector购自宝生物工程（大连）有限公司；PCR仪（T Professional，Biometra）和凝胶成像系统（Fusion FX5-826，VIBER LOURMAT）。

1.3病原分离培养

将采集的样本涡旋振荡1 min，吸取0.1 mL上清液分别涂布于添加抗生素（含终浓度100 mg/L氯霉素、终浓度500 mg/L放线菌酮）的沙氏琼脂平板（SDA）上，分别于37 ℃培养7 d。将SDA上出现的菌落分离纯化。

1.4rDNA ITS序列分析

按照文献［15］合成真菌ITS扩增通用引物ITS5 （5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'）和ITS4 （5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'），提取分离培养后48 h的真菌基因组DNA，PCR扩增ITS序列。反应体系为：2× Taq PCR MasterMix，12.5 μL ；ITS 4 （10 μmol/L），0.5 μL；ITS 5（10 μmol/L），0.5 μL；模板DNA（100～300 ng），2 μL；ddH2O补至25 μL。反应条件为：94 ℃变性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃30 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。

将PCR产物回收后连接pMD19- T Simple Vector，转化至感受态细胞DH5α，并挑取克隆进行测序。通过NCBI（www.ncbi.nlm.nlm.nih.gov）数据库的BLAST程序对ITS测序结果进行同源性检索和比对，并通过MEGA 5.0软件使用邻近法（NJ法）对分离真菌ITS序列和参考序列构建系统发育树。

1.5真菌药敏试验

使用 ATB FUNGUS 3 真菌药敏试剂条测定分离真菌的最小抑菌浓度 MIC值（mg/L），包括5-氟胞嘧啶（5-FC，浓度为4～16 mg/L）、两性霉素B （AMB，浓度为0.5～16 mg/L）、氟康唑（FCA，浓度为1～128 mg/L）、伊曲康唑（ITR，浓度为0.125～4 mg/L）和伏立康唑（VRC，浓度为0.06～8 mg/L）。

按照试剂盒操作说明书进行操作：选择沙氏培养基对疣状毛癣菌进行培养72 h，使用0.85%的生理盐水制备相当于2个麦氏浊度的悬浮液。将20 μL悬浮液转移到含有ATB F2培养基的安培瓶中并混匀，将混匀后菌液按135 μL/孔接种至ATB试剂条，37℃培养72 h。将试剂条放在黑暗的背景下，肉眼读取药敏结果。以对照孔生长良好，而含药最高稀释孔不生长者为最小抑菌浓度的终点，即MIC值。参照文献［16］中的判定标准进行耐药性分析。

2　结果与分析

2.1真菌的分离与鉴定

在SDA平板上分离纯化得到的10株真菌，均呈现中心蜡状成堆，边缘“杉树状”。对所有分离真菌进行rDNA ITS片段扩增，均得到约600 bp的单一清晰条带。根据分离真菌ITS序列在NCBI数据库中比对结果，及结合数据库中疣状毛癣菌（NCBI登录号：AB443930、AF168126、KP455492、LN614523、KJ606084、Z98002）ITS序列构建的系统发育树分析显示，分离真菌序列与疣状毛癣菌参考序列明显聚为一支（图1），确定所分离真菌为疣状毛癣菌。

图1　NJ法构建的分离真菌系统发育树（Bootstrap值为1000）

2.2药敏试验结果

所分离的疣状毛癣菌药敏试验结果一致，均对5-氟胞嘧啶、两性霉素B耐药，对氟康唑为中介，而对伊曲康唑和伏立康唑均为敏感（表1）。

表1　10株疣状毛癣菌ATB FUNGUS3药敏试验结果

3　讨论

真菌核糖体DNA由核糖体基因及与之相邻的间隔区组成。rDNA序列中内部转录间隔区序列（ITS）作为非编码区变化相对较大，同时ITS片段大小适中，引物通用性强，扩增成功率高，便于进行高通量测序与分析，并能够提供详尽的系统学分析所需要的可遗传性状。随着分子生物学技术的发展，真菌核糖体的rDNA ITS序列分析，可以实现真菌种属的快速鉴定［17-18］。本研究通过对临床分离真菌的ITS序列分析，实现了对其种属的准确、快速鉴定。相对于传统的形态学方法，基于ITS序列分析的真菌种属鉴定技术所需时间更短，并能实现“非专家鉴定”。本研究从具有皮肤癣病的奶牛临床样品中分离得到10株疣状毛癣菌，这与Papini［2］、Takatori［4］、Khosravi［6］、Aghamirian［7］、Ming［8］等国内外学者的分离结果一致。

发生真菌感染后，及时进行真菌培养和药敏试验、明确病原学诊断和对抗菌药物的敏感性、正确选用抗真菌药物是真菌感染治疗成功的关键。ATB FUNGUS 法由于其具有便利性、结果判读客观、易于标准化、易于操作等优点，在真菌体外药敏试验中的应用越来越广泛［19-20］。本研究采用ATB FUNGUS3法，使用法国梅里埃公司试剂盒进行疣状毛癣菌体外药敏试验，结果发现其对伊曲康唑和付立康唑均敏感，其中伊曲康唑的MIC为0.125 mg/L。崔鹏博采用NCCLS的M38-A方案对其分离的疣状毛癣菌进行药敏试验，结果是伊曲康唑的MIC在0.625～2.5 mg/L之间，是本研究结果的5 ～20倍，这可能是由于所分离的菌株不同，以及药敏试验方法不同造成的。

疣状毛癣菌是一种重要的人兽共患性真菌，其感染具有明显的职业性。本研究基于真菌核糖体ITS序列分析实现了对疣状毛癣菌的快速准确鉴定，并通过ATB FUNGUS 3法确定了本研究中分离的疣状毛癣菌的体外敏感性药物-伊曲康唑和伏立康唑，为疣状毛癣菌的鉴定治疗和预防提供了基础。

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（责任编辑：朱迪国）

中图分类号：S852.661

文献标志码：A

文章编号：1005-944X（2016）01-0026-04

基金项目：河北出入境检验检疫局科研项目（HE2013K032）病原菌［6-7］。我国新疆地区一处荷斯坦奶牛场的癣病发病率为20%［8］；崔云鹏从28例具有癣病症状的临床样品中分离到17株疣状毛癣菌［9］。

Isolation and Identifi cation of Trichophyton Verrucosum in Cows and Analysis on Vitro Drug Resistance

Wang Jianchang，Jiang Yanfen，Wang Shen，Wang Jinfeng
（Technical Center of Hebei Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Shijiazhuang，Hebei 050051）

Abstract：In order to explore the dermatophyte situation of the dairy cows and the antifungal susceptibility，the hair and skin specimens were collected from the skin lesions of Holstein cows with the typical ringworm symptoms. The pathogens were isolated and identifi ed through ribosome DNA ITS sequence analysis. The MIC of 5-fl uorocytosine（5-FC），amphotericin B（AMB），fl uconazole （FCA），itraconazole （ITR）and voriconazole（VRC）were determined by ATB FUNGUS 3. The results showed that the isolated fungi all showed waxy raised center，fi rtree periphery. The fungi were identifi ed to be the zoonotic dermatophyte-Trichophyton verrucosum by ITS sequence analysis. The isolated Trichophyton verrucosum was sensitive to ITR and VRC，intermediate to FCA，and resistant to 5-FC and AMB. Trichophyton verrucosum could be identifi ed quickly and accurately by rDNA ITS sequence analysis. ITR and VRC demonstrated it had higher vitro antifungal activity.

Key words：dermatophytosis；Trichophyton verrucosum；ITS sequence；drug resistance；Zoonosis；isolation and identifi cation