微型大白菜“娃娃菜”优异双单倍体的创制与评价

王丽丽+王鑫++吴海东++田云+吕艳玲

摘要：以7个“娃娃菜”优良杂交种为试材进行小孢子培养，通过优化培养条件建立高效培养体系。结果表明，不同基因型间的小孢子胚诱导能力差异极显著，33 ℃条件热击48 h，胚诱导率达最大值；NLN-13+0.05 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA为适宜的诱胚培养基，MS+3%蔗糖+0.75%琼脂+0.1 g/L活性炭是小孢子植株继代和壮苗的适宜培养基，MS+3%蔗糖+0.7%琼脂+0.1 mg/L NAA是小孢子植株适宜的生根培养基。通过游离小孢子培养，获得大量的小孢子胚状体和再生植株195株，筛选获得2个优异的双单倍体（DH系）植株。

关键词：微型大白菜；游离小孢子培养；胚状体；再生植株；娃娃菜；双单倍体（DH系）；热击

中图分类号： S634.102.4文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）06-0236-03

收稿日期：2016-01-07

基金项目：辽宁省科学事业公益基金（编号：2013002001）。

作者简介：王丽丽（1981—），女，河北沧州人，博士，助理研究员，主要从事十字花科蔬菜遗传育种研究。E-mai：wanglili_81@163.com。

通信作者：田云，硕士，副研究员。E-mail：cloudtian@163.com。大白菜是我国主要的蔬菜作物之一，备受育种工作者的关注。随着消费者对大白菜的球色、品质提出更高要求，为满足市场和消费者需求，研究者倾向于注重球色、品质以及品种的新、奇、特等开展各种类型大白菜品种的育种研究。“娃娃菜”别称微型大白菜，其名字起源于中国，是一种小株型、具有特殊食用价值的大白菜，外形美观、可密植、耐贮藏、耐运输，可保证产品的整齐一致，有利于实现产业化。娃娃菜由于生长周期一般为45～50 d，相对较短，因此病虫害也较普通大白菜少，在生长过程中施用农药量也少，是一种绿色、安全的蔬菜。另外，娃娃菜纤维含量较少，营养物质含量更加丰富，口感更好。尽管“娃娃菜”的概念起源于中国，产地和消费市场均在中国，但我国开展娃娃菜育种较国外晚，目前市场上使用最多的却是韩国和日本品种，选育具有自主知识产权的娃娃菜品种是亟待解决的问题。

游离小孢子培养技术在花椰菜、菜薹、芥蓝、普通白菜、大白菜、青梗菜、小松菜等多种芸薹属农作物[1-7]上获得成功，用游离小孢子培养技术创制的双单倍体纯系（DH系）作亲本可以加快育种进程。本试验选用引自韩国的4个娃娃菜杂交种及国内3个娃娃菜杂交种为材料，对影响娃娃菜胚状体发生及其成苗的关键因素如基因型、低温预处理及激素等进行系统分析，以更好地利用游离小孢子培养技术创制新、奇、特蔬菜品种DH系，创新种质资源，丰富大白菜品种类型。

1材料与方法

1.1试验材料

试验于2013年9月在辽宁省农业科学院蔬菜研究所基地进行，试验材料共7个，分别为爱娃、小巧娃娃菜、明月黄娃娃菜、金玲等4个引自韩国的娃娃菜杂交种及秀丽娃娃菜、津夏三号、金春娃2号等3个中国产的娃娃菜杂交种。试材分3批播种，第1批于8月下旬开始，将萌动种子在4 ℃冰箱中春化处理25 d，9月下旬播种于穴盘，11月初栽植于花盆中温室培育，12月中旬至翌年3月开花取样；第2、第3批试材各延迟30 d播种，春化及定植时间顺延。

1.2试验方法

1.2.1游离小孢子培养方法小孢子培养采用常规方法，略有改进。开花期，采集健壮植株上长2～3 mm的花蕾，用流动的清水冲洗5 min，75%乙醇表面消毒30 s，再用0.1% HgCl2溶液灭菌8 min，无菌水洗涤3次，每次5 min；沥干水分，B5液体洗涤培养基中用玻璃棒碾压花蕾，挤出小孢子；小孢子悬浮液经孔径为50 μm的尼龙网过滤，1 100 r/min离心3 min；弃上清液，所得沉淀物即为纯净小孢子；将分离纯化的小孢子用NLN-13培养基悬浮，用直径为60 mm的培养皿分装，每皿5 mL，Parafilm膜封口；33 ℃条件下暗培养，然后转至25 ℃条件下暗培养，直至14～21 d长出肉眼可见的胚状体。

1.2.2小孢子培养体系优化处理方法将分离纯化的小孢子悬浮液分别在33 ℃条件下进行24、48、72 h热击暗培养 21 d，统计胚诱导率，比较33 ℃热击处理不同时间对小孢子胚发生的影响；在NLN-13培养基中添加不同浓度6-BA和NAA培养21 d，统计胚诱导率，比较培养基中6-BA、NAA浓度及其配比对小孢子胚发生的影响；将子叶形胚转入到添加不同浓度6-BA和NAA的MS培养基中培养25 d，统计胚成苗率，比较MS培养基中6-BA、NAA浓度及其配比对小孢子胚成苗的影响；将分生苗转入MS培养基中继代培养，每25～30 d继代1次，9月下旬，将经过多次继代培养获得的试管苗转入到添加不同浓度NAA的MS培养基中培养25 d左右诱导生根，后移至花盆中温室培育。

1.3统计与分析方法

利用流式细胞仪鉴定再生植株倍性；应用DPS 2000统计软件采用邓肯氏新复极法差对数据进行差异显著性分析。

2结果与分析

2.1不同品种小孢子胚诱导情况

由表1可知，NLN-13培养基上培养小孢子14～21 d，7个参试品种中有3个品种诱导出胚状体，诱导率为42.9%；不同品种间的胚诱导能力有极显著差异，津夏三号相对最高，平均每蕾产胚为1.51个。

2.2小孢子胚诱导体系优化

2.2.1热击处理对胚诱导的影响将分离纯化的小孢子悬浮液在33 ℃条件下分别热击暗培养不同时间。由表2可知，热击处理对娃娃菜小孢子胚诱导能力的影响效果明显，同一品种热击培养不同时间，其小孢子胚诱导能力差异极显著；不进行热击或热击培养24 h，津夏三号等3个品种均未诱导出小孢子胚状体；热击48 h为最佳培养时间，胚诱导能量达到最大，津夏三号、秀丽娃娃菜、金春娃2号的平均每蕾产胚分别为1.35、1.08、0.45 个，热击超过48 h，胚诱导能力下降。

2.2.2激素浓度对小孢子胚状体诱导的影响由表3可知，添加适宜浓度6-BA和NAA的NLN-13培养基可以提高胚状体的诱导能力；胚状体发生培养基适宜的激素浓度为 6-BA 0.05 mg/L+NAA 0.05 mg/L，以津夏三号的胚诱导效果最高，平均每蕾产胚1.35个。

2.2.3振荡培养对小孢子胚状体发育的影响将培养15 d的小孢子胚状体在25 ℃恒温摇床上50 r/min继续暗培养发现，与不振荡培养相比，振荡培养有利于促进子叶形胚状体的发育，胚状体生长速度加快（图1-A）。

2.3激素浓度对胚成苗的影响

试验结果表明，子叶形胚转入不含任何激素的MS+3%蔗糖+0.8%琼脂+0.1 g/L活性炭培养基上培养14～21 d，子叶形胚形成愈伤组织（图1-B），并没有形成不定芽，而转入含有 1 mg/L 6-BA、0.1 mg/L NAA的MS+3%蔗糖+08%琼脂+0.1 g/L活性炭培养基上培养，会分生出不定芽（图1-C），添加激素浓度如过高，则影响不定芽的质量，产生畸形苗。在实际操作过程中，最好先将子叶形胚转入不含激素的MS培养基培养，形成愈伤组织后再转入含有激素的MS培养基，以促进更多丛生苗的形成。

2.4继代和生根培养

将获得的小孢子分生苗转入MS+3%蔗糖+0.75%琼脂+0.1 g/L活性炭培养基上进行继代培养，每隔25 d左右继代1次，经2～3次继代，小孢子由纤弱植株逐渐复壮形成再生植株（图1-D）；试管苗长到6～7片真叶时，将壮苗转到MS+3%蔗糖+0.7%琼脂+0.1 mg/L NAA的生根培养基上，培养25 d左右即可生出粗壮、整齐的白色根系，炼苗后移栽至花盆在温室中培育。目前，已经获得195株小孢子再生植株。须说明的是，小孢子植株继代和壮苗培养过程中，在培养基中添加0.1 g/L的活性炭会有利于小孢子植株的复壮。

2.5DH系评价

对获得的再生植株测定其育性及倍性，结果表明，获得的195株再生植株，可育株有167株，不育株有28株，可育株中单倍体植株有4株，双单倍体植株有155株，四倍体植株有8株。经秋季田间性状鉴定，筛选出2个优良的DH系15W05、15W16（图2）。

3讨论与结论

目前，有对春结球黄心大白菜、抗根肿病大白菜、耐抽薹大白菜等游离小孢子培养技术的研究报道[8-10]，主要是对影响胚状体发生及其成苗的关键因素包括基因型、低温预处理及激素等进行系统分析，完善小孢子培养技术体系。本试验将游离小孢子培养技术与育种实践相结合，重点研究娃娃菜游离小孢子的培养，旨在将该技术应用于创制新、奇、特的大白菜品种，以丰富大白菜种质资源。

蒋武生等开展基因型、高、低温预处理、激素对大白菜胚胎发生影响的研究，结果表明，基因型是决定小孢子胚发生的重要因素之一；适当的低温预处理或热击处理能够提高小孢子胚的发生频率；培养基中添加适宜浓度的激素6-BA、NAA能促进小孢子胚状体产生。本试验结果表明，不同品种娃娃菜的小孢子胚诱导能力差异显著；影响小孢子胚状体发生及发育的关键因素主要为热击处理、激素浓度及振荡培养；胚状体发生培养基中添加浓度均为0.05 mg/L的6-BA、NAA，小孢子胚诱导率最高，这与前人研究结果[11-12]一致。小孢子正常是通过不对称核分裂后发育成花粉，而要让小孢子发育成胚，就要阻断原有的配子体发育，使小孢子进行对称性分裂向孢子体方向发育，才能诱导小孢子胚的发生[13-16]。姜立荣等观察白菜小孢子发现，单核晚期，小孢子大部分都有1个清晰的占整个细胞50%以上的大液泡，25 ℃条件下小孢子会进行不对称分裂，而经过32 ℃处理，对称分裂成为其主要的分裂方式[13]。本试验中，热击预处理对娃娃菜小孢子胚发生的作用最为明显，分离纯化的小孢子悬浮液在33 ℃条件下热击 24 h，未诱导出小孢子胚状体，热击48 h则胚诱导效果达到最大值，热击超过48 h时胚诱导能力下降，这说明热击处理也是影响小孢子胚发生的重要因素之一。

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