重组人纤维蛋白原基因在毕赤酵母中的高效表达

郝荣华，张晓元，刘飞,,3Δ，陈勉，王凤山，朱希强,,3，凌沛学,,3

(1.山东省药学科学院 山东省生物药物重点实验室 山东省多糖类药物工程实验室 多糖类药物发酵与精制国家地方联合工程实验室，山东 济南 250101；2.山东大学 药学院，山东 济南 250012；3.山东福瑞达医药集团公司，山东 济南 250101)

重组人纤维蛋白原基因在毕赤酵母中的高效表达

郝荣华1，张晓元1，刘飞1,2,3Δ，陈勉1，王凤山2，朱希强1,2,3，凌沛学1,2,3

(1.山东省药学科学院 山东省生物药物重点实验室 山东省多糖类药物工程实验室 多糖类药物发酵与精制国家地方联合工程实验室，山东 济南 250101；2.山东大学 药学院，山东 济南 250012；3.山东福瑞达医药集团公司，山东 济南 250101)

目的 构建含有人纤维蛋白原基因的毕赤酵母表达系统，实现胞外高效分泌表达。方法 全基因合成人纤维蛋白原3个基因FGA、FGB、FGG，构建表达载体 pGAPZαA-FGB-FGG-FGA-AOX1，线性化后电转化导入毕赤酵母菌株SMD1168H，抗性筛选获得阳性克隆。发酵液经SDS-PAGE确定蛋白表达部位，ELISA检测目的蛋白表达量。表达产物超滤浓缩后利用AKTA蛋白纯化系统进行分离纯化，Western blot检测蛋白表达情况并对纯化产物进行生物学活性测定。结果 基因工程菌株摇瓶培养上清液表达量约15 mg/L，生物学活性分析重组蛋白具有凝集活性。结论 成功获得了高效分泌表达重组人纤维蛋白原的毕赤酵母菌株，且分离纯化的蛋白具有生物凝集活性。

重组人纤维蛋白原；毕赤酵母；分泌表达；分离纯化

目前世界卫生组织确认的凝血因子共13个，大多由肝脏产生，正常情况下，所有凝血因子都处于无活性状态，以无活性酶原形式存在，当某一凝血因子被激活后，可使许多凝血因子按一定的次序先后被激活，逐级放大，直到纤维蛋白形成，血液发生凝固。纤维蛋白原(fibrinogen，Fg)，即凝血因子Ι，是参与血液凝固的重要凝血因子，血浆中含量高达2 000～4 000 mg/L[1]，其分子量340 kDa，由完全相同的2个亚基组成共价二聚体，每个亚基含有 α(63.5 kDa)、 β(56 kDa)、 γ(47 kDa)3条肽链[2]，分别由4号染号体(4q28-30)上的3个独立的基因FGA、FGB、FGG编码形成，在肝脏中由独立的核糖体合成其前体蛋白，再经过内质网和高尔基体完成蛋白的组装，各肽链彼此通过二硫键相互连接形成Fg单体。2个单体通过3对链间二硫键连接形成对称性二聚体，即Fg。

纤维蛋白原参与凝血过程的机理：当血液中的凝血酶原被激活时，凝血酶作用于纤维蛋白原，切断纤维蛋白原α链N末端区域和β链N末端区域，α链的解离有利于纤维蛋白网络呈线性增长，β链的解离有利于纤维蛋白网络呈侧向增长，最终纤维蛋白单体以错综重叠状态侧向聚合缔结为网络构成的血凝块[3]。凝血初期非共价键结合可溶性的血凝块，然后在体内凝血因子ⅩⅢ(谷氨酰胺转移酶，又称纤维蛋白稳定因子)和Ca2+作用下，纤维蛋白单体通过 ε-氨基-γ-谷氨酰基连接，形成不溶性的稳定血凝块[4]，从而发挥凝血和生理性止血功能。另外，纤维蛋白原还参与体内血小板聚集、纤溶调节、动脉硬化的发生发展、组织损伤及修复等一系列病理和生理过程[5-8]。

医药级纤维蛋白原提取于人体血液，生产成本高昂且难以避免血源性传染病(如乙肝和艾滋病等)的传播风险，影响其市场应用及推广。随着分子生物学发展，采用基因工程方法高效表达安全、可靠的人纤维蛋白原成为研究热点。2011年，黄星等[9]将人纤维蛋白原基因在大肠杆菌BL21菌株中进行诱导表达，发现人纤维蛋白原3个亚基不能共表达，即纤维蛋白原的β、γ链能用pET系列载体获得表达，而α链却未能获得表达。大肠杆菌等原核生物表达系统还存在目的蛋白无法正确折叠修饰等空间结构问题，影响纤维蛋白原生物活性。动物细胞表达系统中，虽然可以通过哺乳动物乳腺生物反应器获得特异性表达具活性的纤维蛋白原，但存在投入成本高、基因打靶的位置效应导致基因整合具随机性、重组蛋白与天然蛋白修饰加工仍存在差异等问题，难以实现规模化生产[10-11]。酵母表达系统可以克服大肠杆菌和动物细胞表达系统的不足，通过高密度发酵实现工业化生产，蛋白质翻译后的修饰加工功能更加完善，蛋白产物更接近天然蛋白质功能。本研究拟通过构建重组人纤维蛋白原酵母表达载体获得高效分泌表达的毕赤酵母菌株，分离纯化具生物活性蛋白，为进一步开发有效的药用纤维蛋白原奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒与菌株：质粒pGAPZαA(Invitrogen)，含有GAP启动子和Zeocin抗性基因，作为表达载体；质粒pPIC9K，仅用于AOX1基因的PCR扩增，并将该基因连接入pGAPZαA表达载体，利用AOX1作为线性化位点进行同源重组，以上质粒均为本实验室保藏。菌株以毕赤酵母(Pichiapastoris)SMD1168H作为表达宿主，为本实验室保藏。

1.1.2 培养基：低盐LB培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，氯化钠5，pH 7.5；YPD培养基(g/L)：胰蛋白胨20，酵母粉10，葡萄糖20，固体培养基含1.5%琼脂粉。

1.1.3 试剂：限制性内切酶、T4 DNA连接酶等购自NEB公司、Taq酶、DNA Marker、蛋白分子量Marker等购自Fermentas公司，抗生素Zeocin购自Invitrogen公司，质粒抽提试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、DNA胶回收试剂盒购自Omega公司，超滤管购自Millipore公司，层析柱填料Sephacryl TM S-100 HR购自GE 公司，ELISA 试剂盒购自Bio-Swamp公司，鼠抗人单克隆抗体(α、β、γ)、辣根过氧化物酶偶联的羊抗鼠 IgG 均购自Santa Cruz公司，DAB显色试剂盒购自Tiangen公司。其他试剂均为市售分析纯。

1.1.4 仪器：摇床(伊孚森生物技术中国有限公司)、 PCR仪(Eppendorf)、离心机(Thermo)、电转化仪(Biorad)、酶标仪(Tecan)、蛋白电泳设备(Biorad)、AKTA蛋白分离纯化仪(AKTA Explorer)、生物样品均质器(Bertin )。

1.1.5 引物序列:

FGA-F:GACTGCTGATAGTGGAGAGGGTGAC

FGA-R:GTGAAGGTTTACCCAAAGGGGATG

FGB-F:GTCCTTCCATAAATTGAAGACTATG

FGB-R:ATCTTTCTCATACTGTACCATGATC

FGG-F: TATCCTTTATTTTTACGCATTGTTG

FGG-R:ATGCTGTTGACCTTCTCCGATAGTC

1.2 方法

1.2.1 pGAPZαA-FGB-FGG-FGA-AOX1重组质粒的构建:NCBI数据库检索人纤维蛋白原FGA、FGB、FGG基因序列(Gene ID分别为2 243、2 244、2 266)，根据宿主菌株毕赤酵母密码子偏好性进行序列优化，并设计合适的酶切位点，对含GAP启动子和AOX1TT终止子表达框的全基因序列合成，重组质粒载体如图1所示，具体步骤如下：

图1 重组人纤维蛋白原酵母表达载体的构建图Fig.1 Frame of the Pichia pastoris expression vector containing recombinant human fibrinogen gene

① 限制性内切酶NheⅠ、BamHⅠ分别双酶切FGB基因和 pGAPZαA 质粒，经纯化连接转化E.coliTop10 感受态细胞，于25 μg/mLZeocin低盐 LB 固体培养基筛选阳性转化子，获得pGAPZαA-FGB重组质粒。

② 限制性内切酶BglⅡ分别单酶切FGG基因和 pGAPZαA-FGB质粒，载体脱磷酸化并纯化，连接转化E.coliTop10 感受态细胞，抗性筛选获得pGAPZαA-FGB-FGG重组质粒。

③ 限制性内切酶NdeⅠ分别单酶切FGA基因和 pGAPZαA-FGB-FGG质粒，载体脱磷酸化并纯化，连接转化E.coliTop10 感受态细胞，抗性筛选获得pGAPZαA-FGB-FGG-FGA重组质粒。

④以pPIC9K质粒为模板PCR扩增AOX1基因，PstⅠ单酶切AOX1基因和pGAPZαA-FGB-FGG-FGA重组质粒，载体脱磷酸化并纯化，连接转化E.coliTop10 感受态细胞，抗性筛选获得pGAPZαA-FGB-FGG-FGA-AOX1重组质粒。

每一步重组质粒构建均经生物公司测序正确后，再进行下一个目的片段的连接。

1.2.2 毕赤酵母的电转化及PCR扩增验证：PmeⅠ单酶切线性化重组质粒pGAPZαA-FGB-FGG-FGA-AOX1，胶回收纯化，按《毕赤酵母表达操作手册》[12]方法电转化导入毕赤酵母SMD1168H感受态细胞，电转化条件：1.5 kV，200 Ω， 25 μF。电转化后酵母细胞涂布于含1 μg/mLZeocin抗性平板，28 ℃培养2 d，筛选阳性转化子，以破壁重组子为模板，PCR扩增检测重组载体的FGA、FGB、FGG基因验证。

1.2.3 重组人纤维蛋白原的表达：挑取单克隆于YPD培养基(含1 μg/mLZeocin)，28 ℃，220 r/min培养60 h。采用生物样品均质器对发酵液及菌体破碎，均质速度6 500 r/min，3个循环，每个循环运行时间为30 s，循环间隔30 s。参考《精编分子生物学实验指南》[13]对全细胞破碎液、菌体沉淀破碎液及发酵上清液进行SDS-PAGE 电泳检测，确定目的蛋白的表达部位，ELISA试剂盒检测确定目的蛋白的表达量。

1.2.4 重组人纤维蛋白原的 Western blot检测：发酵上清液经30 kDa超滤管浓缩，AKTA纯化系统分离，收集蛋白吸收峰值处洗脱液进行二次超滤浓缩获得纯化蛋白。纯化条件：分子筛层析柱Column XK16，凝胶填料为SephacrylTMS-100 HR，流速0.5 mL/min，上样量 5mL。

纯化蛋白分别以小鼠单克隆一抗(α、β、γ)(稀释比例1 :1000)，羊抗鼠 IgG-HRP作为二抗(稀释比例 1:10 000)进行Western blot，抗体孵育结束后洗膜3次，DAB 显色试剂盒显色，具体操作方法参考《精编分子生物学实验指南》[13]。

1.2.5 重组人纤维蛋白原的生物活性测定:AKTA纯化蛋白洗脱液4 ℃透析过夜(20 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 5 mM εACA,1mM CaCl2)，添加外源0.1 U/mL凝血酶、0.02 U/mL凝血因子ⅩⅢ，37 ℃条件下参照2015年版中国药典方法[14]检测纤维蛋白原凝集活性。

2 结果

2.1 毕赤酵母基因工程菌株的PCR扩增检测 以电转化筛选到阳性转化子破壁后的菌液为模板，PCR扩增FGA、FGB和FGG基因，1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图2，目的片段大小与理论值(1.9 kb、1.5 kb、1.3 kb)相一致，说明重组质粒成功在毕赤酵母基因组中同源重组。

图2 阳性酵母转化子的PCR验证1：1Kb DNA Marker；2：FGG基因；3：FGB基因；4：FGA基因Fig.2 PCR amplification of human fibrinogen DNA fragments in Pichia pastorisLane 1: 1Kb DNA Marker ;Lane 2:FGG gene ;Lane 3: FGB gene; Lane 4:FGA gene

2.2 重组人纤维蛋白原的表达 SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达情况见图3，与含pGAPZαA空载体毕赤酵母对照相比，在相对分子质量40～70 kDa之间，上清液(泳道2)及全细胞破碎液(泳道3)均有3条特异性条带，而菌体沉淀和对照没有条带，这表明目的蛋白表达部位主要在胞外上清液中，属于分泌型表达。ELISA试剂盒检测结果显示毕赤酵母上清液中目的蛋白表达量约为15 mg/L。

图3 毕赤酵母表达人纤维蛋白原的SDS-PAGE检测1：蛋白Marker；2：重组质粒转化毕赤酵母的上清液；3：重组质粒 转化毕赤酵母的全细胞破碎液；4：重组质粒转化毕赤酵母的菌体沉淀 破碎重悬液；5：pGAPZαA空载体转化毕赤酵母的表达Fig.3 SDS-PAGE analysis of the expression of recombinant human fibrinogen in Pichia pastorisLane 1: Protein molecular weight Marker; Lane 2: Expression of recombinant proteinin culture supernatant; Lane 3: Expression of recombinant protein in whole- cell; Lane 4: Expression of recombinant protein in precipitate;Lane 5: Proteins expressed by pGAPZαA in Pichia pastoris as a control

为进一步确定蛋白的表达情况，利用小鼠单克隆一抗(α、β、γ)和羊抗鼠IgG-HRP二抗进行Western blot检测，结果见图4，与pGAPZαA空载体转化毕赤酵母的对照相比，样品的FGA、FGB、FGG蛋白(泳道2)均有明显的特异性条带，蛋白分子量大小与理论值α(63.5 kDa)、 β (56 kDa)、 γ(47 kDa)相一致，表明杂交条带确为目的蛋白，重组人纤维蛋白原FGA、FGB、FGG蛋白在毕赤酵母中均有较强的表达。

图4 人纤维蛋白原 Western blot印迹分析 A.重组人纤维蛋白原FGA蛋白；B.重组人纤维蛋白原 FGB蛋白；C.重组人纤维蛋白原FGG蛋白1：蛋白Marker；2：重组人纤维蛋白原蛋白表达样品；3：空载体对照Fig.4 Western blot of human fibrinogen A.FGA protein; B.FGB protein; C.FGG proteinLane 1: Protein molecular weight Marker;Lane 2: Proteins expressed by pGAPZαA-FGB-FGG-FGA-AOX1 in Pichia pastoris;Lane 3: Proteins expressed by pGAPZαA in Pichia pastoris as a control

2.3 重组人纤维蛋白原的生物活性检测 分离纯化后的重组人纤维蛋白原在添加外源Ca2+、凝血酶和凝血因子ⅩⅢ条件下，按照2015年版中国药典方法检测凝固活力[14]，结果显示待测样品与对照相比变浑浊并有沉淀产生，这表明纯化获得的人纤维蛋白原具有生物凝集活性。

3 讨论

人纤维蛋白原在凝血系统中发挥着关键作用，在凝血酶的作用下，纤维蛋白原转变为纤维蛋白，并与其他血细胞成分聚集从而达到止血目的。纤维蛋白原缺乏常见疾病有：先天性纤维蛋白原减少或缺乏症，弥散性血管内凝血、外伤、手术等导致的获得性纤维蛋白原缺少症，这些纤维蛋白原功能异常均可引发不可控制的出血症状[15]。目前纤维蛋白原缺乏症只能靠补充人纤维蛋白原制剂治疗，因此临床应用需求较大，同时人纤维蛋白原还是一种军事战略储备药品，每年必须有一定的储备量。目前我国仅有9家血液制品单位生产人纤维蛋白原注射剂，2008～2010年全国总产量不足10万瓶(0.5 g/瓶)，临床长期供不应求，且原料来源于人体，提取资源短缺、工艺复杂，因此利用基因工程手段开发重组人纤维蛋白原具有良好的市场前景，有助于为科研和临床治疗提供新思路，为其大规模产业化生产提供重要的实验依据和技术支持。

本课题将人纤维蛋白原的3个基因串联插入到真核表达载体 pGAPZαA中，成功获得了重组人纤维蛋白原的毕赤酵母菌株，SDS-PAGE和Western blot检测证实目的蛋白在发酵上清液中得到高效分泌表达，且分离纯化的蛋白具有生物凝集活性。目前仅有2008年Tojo等[16]报道利用酵母作为宿主细胞表达人纤维蛋白原的研究，表达量仅为8 mg/L，且需甲醇诱导表达，而本研究获得的人纤维蛋白原发酵产量约为15 mg/L，较其产量提高了87.5%，毕赤酵母表达为组成型表达，不需要诱导，更适合工业上大规模生产。本课题后续将进行发酵罐扩培和发酵条件优化，以提高蛋白表达量，并将从氧化还原角度和蛋白翻译后修饰角度探索二硫键形成和稳定条件，对纤维蛋白原在凝血酶作用下的凝集条件进行大量的研究和探索。

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(编校：吴茜)

High level expression of recombinant human fibrinogen inPichiapastoris

HAO Rong-hua1, ZHANG Xiao-yuan1, LIU Fei1,2,3Δ, CHEN Mian1, WANG Feng-shan2,ZHU Xi-qiang1,2,3, LING Pei-xue1,2,3

(1.Shandong Academy of Pharmaceutical Sciences, Key Laboratory of Biopharmaceuticals, Engineering Laboratory of Polysaccharide Drugs,National-Local Joint Engineering Laboratory of Polysaccharide Drugs, Ji’nan 250101, China; 2.School of Pharmaceutical Sciences,Shandong University, Ji’nan 250012, China; 3.Shandong Freda Pharmaceutical Group Company, Ji’nan 250101, China)

ObjectiveTo construct a eukaryotic expression vector inPichiapastoriscontaining human fibrinogen gene, in order to achieve high level secretory expression in extracellular.MethodsExpression plasmid，pGAPZαA-FGB-FGG-FGA-AOX1，was constructed by inserting the synthesized sequence encoding human fibrinogen(FGA,FGB,FGG) and then introduced intoPichiapastorisSMD1168H by electroporation.Transformants were availably screened byZeocinresistance,the expression of recombinant protein was identified by SDS-PAGE and Western blot analysis, the protein yield was tested by ELISA assay.After ultrafiltration and purification, the biological activity of protein was detected.ResultsThe crude yield of human fibrinogen inPichiapastorissupernatant reached 15 mg/L in flask and the biological aggregation activity was determined.ConclusionThe human fibrinogen gene was obtained and successfully expressed inPichiapastorisand the active products were secreted into the medium.

recombinant human fibrinogen;Pichiapastoris; secretory expression; purification

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.11.001

山东省自主创新成果转化专项(2014CGZH1306)；济南市自主创新产业化重大专项(201403009)；山东省重点研发计划(2015GSF121003)；山东省科技重大专项(重大关键技术)(2015ZDJS04002)；山东省自然科学基金企业先导技术联合基金(ZR2015QL007)

郝荣华，女，博士，助理研究员，研究方向：基因工程药物，E-mail：ronghua34@163.com；刘飞，通信作者，男，硕士，助理研究员，研究方向：生物技术，E-mail：lfshwu@163.com。

Q786

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