铜绿假单胞菌产生耐药性的机制

孟鑫，尚德静

(辽宁师范大学 生命科学学院，辽宁 大连 116081)

铜绿假单胞菌产生耐药性的机制

孟鑫，尚德静Δ

(辽宁师范大学 生命科学学院，辽宁 大连 116081)

铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa，P.aeruginosa)与其它革兰氏阴性菌相比，其外膜渗透性低，并且多种耐药机制协同作用，更容易表现出对大多数抗生素极低的易感性，从而加入了“超级细菌”的行列。最近使用突变体库筛选，微阵列技术和突变频率分析已经证实在体内生长条件或复杂的适应条件下(如biofilm生长或群体迁移)，抗生素本身也能够诱发非常大的基因团簇突变从而导致耐药性以及新的适应性抗性。

铜绿假单胞菌 耐药性 适应性抗性

自临床引入抗生素并滥用抗生素以来，细菌具有越来越复杂的耐药性，导致“超级细菌”的出现和扩散，几乎对市场上所有可用的抗菌药物都有一定的抗性。铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa，P.aeruginosa)是革兰氏阴性细菌，可以广泛感染动植物宿主[1]，常见的医院感染中有10～15%是由其引起的[2]，主要引起了囊性纤维化(cystic fibrosis，CF)患者的慢性肺部感染[3-4]。此外，P.aeruginosa是呼吸机相关性肺炎(ventilator associated pneumonia，VAP)最常见的致病菌之一[5-6]，P.aeruginosa引起的肺炎，常常导致急性肺损伤和继发性脓毒症，造成高死亡率[7-11]。

与其他病原体相比，P.aeruginosa对多种抗生素(包括氨基糖苷类，氟喹诺酮类和β-内酰胺类)显示出较强的内源性抗性。例如：对羧苄青霉素的内源性抗性使得大多数β-内酰胺类(包括美罗培南而非亚胺培南)抗生素的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)增加4～8倍；对非β-内酰胺抗生素如喹诺酮，甲氧苄氨嘧啶，四环素和氯霉素也有一定的内源性抗性。这种内源性抗性主要源于其极低的外膜渗透性或外排系统被激活产生的去抑制作用。P.aeruginosa外膜中存在大量无效的成孔蛋白，限制了抗生素分子穿入细胞的速度[12]，使得次级适应性抗性机制能更有效地运行，如增加外排功能和酶对抗生素的修饰。

这些内在机制是P.aeruginosa遗传组成的一部分，可以通过突变来稳定或增强，有些突变影响耐药性基因的表达及产物的活性从而导致MIC变大，使许多常见的抗生素对P.aeruginosa没有效果，其他突变可能轻微地增加耐药性，使P.aeruginosa在大多数抗生素作用下的易感性逐渐降低，此外，一些菌株还可以通过水平转移(即菌株之间)抗性基因决定簇增加耐药性。

除了内源性抗性这种比较传统的耐药机制，近年来发现P.aeruginosa对不断变化的环境条件和胁迫有很强的适应性，也可以引起对抗生素的适应性抗性，如接触抗生素，改变培养基条件或改变生长状态等[13]，这种适应性抗性的现象早就报道过，然而，最近才研究其对临床问题的广泛适用性。

虽然抗生素对多数由P.aeruginosa引起的感染有效，但是其仍可以通过多种方式产生耐药性，导致耐药率不断增加，加之其内源的高耐药性，使得开发新的药物非常具有挑战性。为此，了解P.aeruginosa产生耐药性的机制是非常重要的，本文描述了有关P.aeruginosa耐药机制的最新发现，并分析抗生素在临床治疗的相关现象。

1 内源性耐药

P.aeruginosa对大多数的抗生素，如青霉素G、氨基青霉素，第一代和第二代头孢菌素等β-内酰胺类药物具有天然耐药性，与其他革兰氏阴性细菌相比，野生型的P.aeruginosa的外膜渗透性低(比大肠杆菌的渗透性低12～100倍)，使其对抗生素具有极低的易感性。革兰氏阴性细菌的外膜是抵制抗生素入侵的选择性屏障[12]，常常被比作分子筛，大多数亲水性分子通过细菌细胞外膜上通道蛋白的水分子扩散进入细菌，所以扩散效率与抗生素分子的体积大小有关。P.aeruginosa细胞外膜中成孔蛋白F(Outer membrane channel proteins F，OprF)数量较少，所形成的大的通道数量少，因此其对抗生素分子的进入具有很大的限制，而其它形成小体积通道的成孔蛋白如外膜通道蛋白D(Outer membrane channel proteins D，OprD)和外膜通道蛋白B(Outer membrane channel proteins B，OprB)仅允许小体积的抗生素分子通过，还有些特异性成孔蛋白如OprD，允许碳青霉烯类抗生素摄入；某些阳离子抗菌肽可以通过自我促进方式横过疏水的双分子外膜。虽然低外膜渗透性影响了药物大幅度摄取，但亲水分子可以在几秒钟内横跨外膜，达到内外平衡，说明P.aeruginosa除了具有高内源耐药性，可能还有其它耐药机制，如适应性机制：外排泵被诱导表达，引起药物加速外排；抗性结瘤细胞分裂(resistant nodule cell division，RND)系统MexAB-OprM和MexXY-OprM的表达，以及AmpC(一种由P.aeruginosa的染色体或质粒介导产生的一类β-内酰胺酶，属β-内酰胺酶Ambler分子结构分类法中的C类)β-内酰胺酶的产生也有助于降低抗生素跨外膜流动[14]。

此外，生物膜(biological film，biofilm)本身就具有抵制抗生素的能力。最近的研究提出了biofilm的抗性作用的几种方式：第一，biofilm基质可以充当扩散性渗透的屏障，阻止抗生素到达其靶位；第二，biofilm内的微环境使细菌生长缓慢，例如还原氧区；第三，biofilm内的细菌亚群似乎分化为持久性细菌，大大降低了对抗生素的易感性；最后，biofilm内存在几种特异性调节的抗性基因。

最近，通过对导致抗生素敏感性增加的突变体的突变体库筛选研究[15-19]，提出了P.aeruginosa对抗生素内源性抗药的几种新机制。即来自不同功能类的几十个基因可参与突变，并且这种突变形成了基因团簇的一部分。例如，突变株在许多基因中可以影响DNA的复制、重组及修复，从而显示对环丙沙星敏感性增加。有趣的是，细胞分裂基因ftsK中的突变对环丙沙星和β-内酰胺也有抗性作用[16-18]。同样地，参与藻酸盐合成的基因突变对β-内酰胺亚胺培南的易感性增加[20]。

目前，在用亚抑制或致死浓度抗生素治疗的微阵列实验中观察到失调基因和耐药性基因之间的重叠，这表明P.aeruginosa适应性地激活防御机制以抵御抗生素的抑制作用。这些研究共同证明了P.aeruginosa的高耐药性是几种同时作用的机制最终作用的结果，其潜在的机制可能会在临床结果中发挥重要作用。

2 获得性耐药

2.1 不同菌株间的水平转移(horizontal transfer) 除内源的高耐药性之外，P.aeruginosa还可通过部分可遗传性状增加耐药性[21]。获得性耐药的两种类型包括遗传元件的水平转移和突变性。DNA元件(包括质粒，转座子，整合子，原噬菌体等)可以携带并且能够通过接合、转化或转导的方式获得抗生素抗性基因，从而增加抗生素抗性，甚至由于质粒包含多个抗性盒而具有多药耐药性[22]。这种水平转移主要增强了P.aeruginosa对氨基糖苷类和β-内酰胺类的抗性，对其它几类抗生素也有一定影响，例如：可移动遗传元件上的氨基糖苷修饰酶灭活氨基糖苷类，导致氨基糖苷类的各种化学修饰，同时引起30S核糖体亚基(氨基糖苷类的主要靶标)亲和力降低[22]。一些P.aeruginosa菌株除了有AmpC β-内酰胺酶外，还获得了编码新的β-内酰胺酶的质粒[23，从而对青霉素和头孢菌素产生耐药性，因此，P.aeruginosa对β-内酰胺抗生素获得性耐药的主要机制是β-内酰胺酶的产物对β-内酰胺类抗生素有抗性。目前，令人关注的是质粒介导的广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases，ESBLS)的增殖和金属-β-内酰胺酶(metal-beta-lactamase，MBL)对碳青霉烯类的灭活。

2.2 突变性 获得性耐药的第二种形式是突变。细菌在胁迫条件下存活的关键机制之一是自发突变[16]，对付某个单一抗生素的自发突变频率是10-6至10-9。但在DNA损伤剂的存在下或在biofilm的生长期间，突变率可以进一步增加[25-30]，例如：当细菌与亚抑制浓度的环丙沙星预孵育时，美罗培南的突变频率增加了十倍；在biofilm生长期间，抗氧化酶下调导致DNA损伤增加，被biofilm包被的细菌对环丙沙星抗性的突变频率与浮游细胞相比增加了100倍以上，另外biofilm包被的细菌在休眠细胞持续发育等因素影响下对抗生素抗性增加1000倍；此外，抗生素抗性分离株的出现主要与DNA错配修复系统中的突变相关，由于错配修复基因mutS，mutL和DNA氧化修复系统基因mutT和mutY中的突变引发了超强突变体，通常在CF患者中发现，它们通过增加β-内酰胺酶和MexCD-OprJ外排泵的表达量增强抗生素抗性[31-33]。相关的研究还揭示了P.aeruginosa外膜蛋白OprD中含有亚胺培南结合点的环2和环3中的任何突变都能引起构象变化导致碳青霉烯抗性。

P.aeruginosa一旦发生“突破”突变，能导致外排泵过度表达，抗生素摄取减少，β-内酰胺酶超量合成以及抗生素靶点改变，使抗生素失效[34]。P.aeruginosa临床分离株中编码MexR阻遏蛋白的染色体基因发生突变(即mexR突变)，促进mexA-mexB-oprM操纵子转录，使MexA-MexB-OprM过量表达从而对美罗培南易感性降低[35]。另外，由于mexZ突变，MexXY-OprM过表达导致P.aeruginosa临床菌株对氨基糖苷，氟喹诺酮和头孢吡肟产生抗性；特异性孔蛋白OprD中的突变降低了抗生素亚胺培南的摄取，因此导致临床抗性；而mexT或mexS(nfxC)中的突变降低OprD表达以及促进外排泵MexEF-OprN表达导致亚胺培南和多种抗生素抗性；P.aeruginosa中ampD突变性失活引起AmpC β-内酰胺酶部分去阻遏表达，使P.aeruginosa对第三代头孢菌素有获得性抗性；目标酶的突变也可导致临床意义上的抗性[36]，例如gyrA和gyrB(回旋酶)以及parC和parE(拓扑异构酶IV)的突变降低对氟喹诺酮结合亲和力，进而导致临床抗性。

最近使用Harvard文库[37]筛选P.aeruginosaPA14研究表明在大多数条件下许多额外的突变可以导致耐药性适度地增加(2倍)，并且这种增加在临床中很容易被遗漏。文献中已经提出低水平的抗性可以逐步演变为高水平的抗性[38]，在galU(中央中间代谢)，nuoG(能量代谢)，mexZ(转录调节子)或rplY(适应)中的单个突变只表现出对妥布霉素抗性增加两倍，但是四重突变体对其抗性增加16倍[39]，因此，引起MIC中度变化的几种突变的积累可随时间推移导致抗性逐步增加，最终导致高水平抗性。

3 适应性耐药

基因组时代的到来为更广泛地理解适应性耐药的复杂现象提供了条件。目前了解到许多诱发因素能够诱导细菌的适应性耐药，如抗生素，杀虫剂，多胺，pH，厌氧生物，阳离子和碳源，细菌biofilm形成和群体迁移等[13]，这些诱发因素通过调节许多基因的表达从而对外排泵、细胞膜和酶产生影响。

环境因素和亚抑制浓度的抗生素使得P.aeruginosa基因表达模式发生变化，这种变化让细菌可以抵制随后暴露在致死浓度下的抗生素环境。适应性耐药是可逆的，一旦去除诱导因子或条件，细菌就恢复到野生型的易感性，这也解释了为什么在治疗P.aeruginosa引起的感染病，体外效果好的抗生素在体内实验没效果的原因[40]。此外，亚抑制浓度的氨基-辅酶通过氨基糖苷反应调节剂(amino sugar response regulator，ARR)调节细胞内水平的次级中间体分子-环二GMP (cyclic-di-GMP )增强biofilm形成，亚MIC水平的抗生素通过抗生素靶基因中突变的积累促进P.aeruginosa对CF患者肺环境的适应，最终以biofilm的形式在恶劣环境中生存[41]。

聚阳离子抗生素如氨基糖苷类，多粘菌素和阳离子抗菌肽可以与P.aeruginosa外膜上的主要成分脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)相互作用，通过竞争性取代LPS上的二价阳离子而结合到LPS上，引起局部破坏，然后利用这些分子的两亲性特点通过自我促进方式穿过细菌外膜细胞膜[42]。arnBCADTEF操纵子通过向LPS的脂质A中添加4-氨基-阿拉伯糖，可以阻断这种自我促进的摄取，进而导致耐药性。对多粘菌素和阳离子抗菌肽的适应性耐药可以由低浓度的二价阳离子(Mg2+和Ca2+)诱导使两个双组分调节系统PhoPQ和PmrAB活化，随后诱导arn操纵子。最近发现一个新的双组分调节系统ParRS，证明在治疗假单胞菌药物多粘菌素和某些抗菌肽存在的情况下介导了arn操纵子的上调，引起适应性耐药[43]。

另一种适应性耐药机制是亚抑制浓度抗生素暴露而导致编码外排泵基因的过表达。一般来说，与肠杆菌科细菌相比，P.aeruginosa临床分离株对大多数抗生素更不敏感。研究发现某些细菌蛋白质(OprM、OprJ、OprN)具有底物特异性，充当了活性外排系统的组分，因此，P.aeruginosa内源性耐药水平在很大程度上由低膜渗透性和抗生素外排之间的相互作用决定[23]。例如，氨基糖苷类诱导MexXY外排泵过表达，引起某些调节变化，使抗生素更快速地被泵出，并且细菌变得适应性更强。Kohler等人[45]还报道了由于P.aeruginosa突变体nfxC过表达，外排操纵子mexE-mexF-oprN对喹诺酮，氯霉素和曲美他汀产生抗性，同时nfxC突变体还降低了OprD外膜蛋白的表达，因此其还显示对碳青霉烯的交叉抗性。此外，肝泵常常介导多药耐药性。

在biofilm中生长的细菌也观察到外排泵上调和其他耐药机制，biofilm是在上皮和医疗装置的表面上形成微生物聚集体的一种形式。和浮游细胞相比，在群体环境中生长的细菌细胞表现出不同的转录组，并且对许多不同的抗生素有耐药性[46-48]。耐药性表现在几个方面[49]：首先，基因组基因团簇的研究证实许多基因的普遍失调(通过几种机制，包括群体感应)能引起外排泵、酶、各种调节器及产物的表达上调，从而引发耐药性。其次，biofilm内细菌在不同区域获得的营养成分不同，导致其代谢活性有差异，其中生长在外层中的细胞代谢活跃，生长在内部的细胞生长更慢，一些抗生素仅作用于生长旺盛的细胞(例如大多数β-内酰胺和氨基糖苷类)，而多粘菌素优先杀死活力差的细菌，所以对生长在生物膜的不同区域的细菌都有影响。还有研究认为[50]，P.aeruginosa的部分耐药性归因于biofilm中的细胞的缺氧生长模式，发生在厌氧固定相或非生长状态的细胞，易对抗生素产生抗性，而在biofilm内生长旺盛的细胞因为生长环境中有氧并且处于生长状态，多对抗生素易感。虽然细胞外基质已被建议作为抗生素渗透的屏障，但它也可能有浓缩细胞外酶的作用，例如，在细菌表面附近分泌β-内酰胺酶。众所周知，和浮游细胞相比，biofilm更具有持久性，可以容易地经受住应激条件(例如抗生素压力)而缓慢生长或不增殖。关于P.aeruginosa中持久性细胞发育的机制鲜为人知; 然而，已知spoT，relA，dksA，rpoS，dinG，spuC，algR和pilH突变可以影响持久性，这些基因可能是药物克服P.aeruginosa持久性问题和减少耐药性发展的良好靶标。

适应性抗性也可能具有长期后果。如果细胞没有完全根除，一旦停止治疗就可以观察到细菌再生长[51]。

4 讨论与展望

P.aeruginosa可以在某些不复杂的感染中以相当有效的方式被根除。但在慢性CF患者感染中，P.aeruginosa形成biofilm和群体迁移的生活方式，对广谱抗生素具有高度耐药性，即使当对患者施用组合疗法时，也非常难以治疗，并且P.aeruginosa对目前可获得的抗生素的耐药性每年都在增加。由于这些原因，迫切需要发现更有效的药物和新的治疗策略以对抗由该超级细菌引起的感染。因为抗生素的不当使用有助于适应性增强，从而耐药性逐步甚至突破性上升。一旦出现突破性耐药性，能被有效治疗的机会大大降低，所以在临床环境中施用的最佳抗生素剂量需要确定。目前出现的多药耐药P.aeruginosa菌株，还没有有效的抗生素用于治疗，并且这些多药耐药性菌株可能会变得更常见。

进一步的研究希望开发全新的、更有效的抗菌剂或出台新的策略，可以最大限度地减少耐药问题。此外，抗生素在体外和体内效率可能存在差异，需要进行更多的体内研究，以重新评估某些抗生素的体内效率，这将有助于改善抗生素在人体感染中的使用。

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(编校：师维康)

Mechanism of drug resistance ofPseudomonasaeruginosa

MENG Xin, SHANG De-jingΔ

(Faculty of Life Science, Liaoning Normal University, Dalian 116081, China)

Pseudomonasaeruginosaexhibits an inherently reduced susceptibility to most antibiotics compared with most other Gram-negative bacterial species because its low outer membrane permeability and the multiple ways in whichP.aeruginosacan become drug-resistant.Pseudomonasaeruginosahas joined the “super bacteria”. Recent researches, using mutant library screening, microarray technology, and mutation frequency analysis have demonstrated that antibiotics themselves can induce very large groups of genes in vivo growth conditions or complex adaptation conditions (for example, biofilm growth or swarming motility), resulting in resistance as well as new forms of adaptive resistance.

Pseudomonasaeruginosa; resistance; adaptive resistance

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.12.058

孟鑫，女，硕士在读，研究方向：分子遗传学，E-mail:1317302082@qq.com；尚德静，通信作者，女，博士，教授，博士生导师，研究方向：生物化学与分子生物学，E-mail:djshang@lnnu.edu.cn。

R453.2

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