新生抗原在肿瘤治疗中的研究进展

刘郅皓，倪仕鑫，何思远，陈枢青

(浙江大学 药学院，浙江 杭州 310000)

新生抗原在肿瘤治疗中的研究进展

刘郅皓，倪仕鑫，何思远，陈枢青Δ

(浙江大学 药学院，浙江 杭州 310000)

随着对肿瘤研究不断深入，各种新式疗法竞相问世，然而，对抗原的何种性质使免疫系统得以区分癌细胞和正常细胞目前并不清楚。新生抗原(neoantigen)是一种位于肿瘤细胞表面的特异性抗原，它的存在使人类免疫疗法进入到新的领域，使个性化治疗成为可能。新兴的数据表明，这样的新抗原的识别是临床免疫疗法的一个主要因素。它们能在癌症免疫治疗中形成一个生物标志物，进而提供各种治疗方法进攻的靶点，使得T细胞对抗这一类抗原的免疫应答有选择性地增强。

新生抗原；精确细胞免疫治疗；抗原表位；免疫功能

人类对抗肿瘤的历史，从传统的治疗方法，到靶向药物，表观遗传，再到现在热门的免疫疗法，每隔几年就会有新的疗法提出，研究人员不计其数，只是何时能完全攻克，至今未知。2016年3月3日Science发表了一篇关于肿瘤治疗的论文，文章声称他们鉴定出的neoantigens携带了癌症发展最早期的突变，且在所有肿瘤细胞中都有表达，为了解癌症患者对癌症免疫疗法的应答情况，实现个体化癌症治疗铺平道路[1]。本文即对新生抗原在肿瘤治疗中的应用和价值进行综述。

1 免疫疗法新领域——新生抗原

2010年，一项里程碑式的随机临床试验催生了免疫疗法,该试验使用易普利姆玛的治疗手法，演示了抗体能够阻断CTLA-4这一检查点，随后研究人员利用这种治疗方式治疗转移性黑色素瘤患者，并取得了令人鼓舞的成果[2]。此后，以此为基础开展的各种研究表明T细胞介导的免疫疗法对其他一系列人类恶性肿瘤有效[3]。从最初发现免疫系统能抑制癌症生长，到后来发现癌细胞中免疫机制的多重作用，再到目前的各项临床实验，癌症免疫疗法颇有争议，同时也不断有成果出现。在临床上只有20%的患者会对这些治疗方法产生应答，免疫疗法的实际应用仍有很多局限和缺点，因此寻找成功诱发免疫应答的原因是目前亟待解决的问题。

2016年3月11日，van der Burg等[4]在Nature Reviews Cancer发表综述，讨论了如何克服由肿瘤细胞内在因子和肿瘤微环境控制的免疫逃逸相关的过程，总结了如何通过改善疫苗设计、联合疫苗与标准化疗等方式使免疫治疗效益最大化。通过分析一些成功免疫疗法的共性，得出了3个主要因素，其中之一即肿瘤相关抗原的选择。文章还提到，对于那些非病毒诱导的癌症类型，选择何种neoantigens(源于肿瘤细胞的突变)是免疫治疗的重中之重。

Neoantigen，即新生抗原，是一种位于恶性细胞表面主要组织相容性复合物的抗原表位肽。这些抗原不同于正常体细胞表面的人类主要组织相容性抗原HLA，是源自肿瘤特有的突变，具有肿瘤特异性，因而能够被T细胞识别并引起免疫应答。

大量临床数据及各种文献表明对于绝大部分肿瘤患者，内源性T细胞能够对恶性细胞表面特有的抗原肽进行识别[5]。从理论上讲，这样的肿瘤排斥抗原来源有2类。其一是由T细胞耐受不完全的非变异蛋白质组成，其二是由在正常人类基因组中不存在的多肽组成，它对于正常人类基因组来说是“新的存在”。对于没有病毒性致病源的大部分人类肿瘤，这些新的抗原表位仅由肿瘤特异性DNA的改变导致，进而形成新的蛋白质序列。

关于新生抗原的研究报道很多，2015年3月Science发文解释了为何一种抗癌药物只能帮助少数特定的患者，4月出现关于个体化癌症疫苗的报道，5月又有针对突变肿瘤的癌症免疫疗法，2016年报道了针对新生抗原在癌症免疫疗法中的作用[1,6-8]。随着研究的不断深入，采用新生抗原治疗癌症的安全性和可靠性得到了认可，它不仅影响了现阶段的免疫疗法，而且直接导向了个性化医疗,因此对新生抗原的筛选鉴别及利用也逐步开展起来。

2 新生抗原的识别和筛选

新生抗原来自于肿瘤细胞的基因突变。由于突变的特异性，不同患者的肿瘤细胞突变不尽相同，由此产生的新生抗原也各不相同，这与患者DNA密切相关。为筛选需要的特定的突变产生的新抗原，需要了解单个肿瘤患者的基因组。在此基础上，利用基因深度测序技术，通过对患者肿瘤基因组编码的蛋白识别相应的突变，从而预测潜在的新抗原[9]。

这种通过癌细胞外显子组测序技术的识别方式有非常高的识别率，已有实验结果显示，经由测序技术对新生抗原进行识别的结果假阴性的比例较低，且目前已知的绝大多数新抗原都是经由这种覆盖足够广泛的外显子组测序发现的[10]。对应抗原的基因表达水平也可被用来帮助预测抗原决定基丰度[11]。鉴别相应抗原，常用方法有重组表达cDNA克隆的血清学分析技术(serological analysis of recombinantly expressed cDNA clone)，蛋白质组学分析和抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization)。但这些实验技术的实验成本较高，周期较长，且受实验材料的限制，即各种癌症患者的血清或者肿瘤组织。

北京大学医学部Xu等[12]与美国贝勒医学院等单位合作，通过分析在临床上广泛认可和应用的经典肿瘤特异性抗原的表达谱特点，开发出一套独特的被命名为HEPA(heterogeneous expression profile analysis)的算法。研究显示，这种算法能有效从包含数以万计基因的人类全基因组中筛选出与经典肿瘤特异性抗原具有相似表达谱特点的基因。且通过实验验证，初步得到19个新的肿瘤特异性抗原。随后，该团队检测了癌症患者血清中自发产生的对这些肿瘤抗原的特异性抗体。针对肿瘤自身特异性抗体丰度极低的特点，他们开发了一种新的血清学检测方法PARSE (protein A/G based reverse serum ELISA) 。并发现，在约4%～11%的肺癌患者血清中，有4个新的肿瘤特异性抗原产生的自身抗体，而在健康志愿者血清中则少见。在2组独立的肺癌患者血清中，这4种肿瘤特异性抗原联合ROC曲线的曲线下面积均达到0.71以上，提示其可作为肺癌的联合诊断标志物。

3 高效、活性的新生抗原选择

新抗原是肿瘤中的突变多肽，在正常组织中是不存在的。对应于不同的突变，这些新抗原也会表现出肿瘤内异质性。其中一些属于一级克隆(所有肿瘤细胞中都有)，还有一些是亚克隆(只存在于一部分细胞中)。即便是在所有肿瘤细胞中都表达的抗原，对免疫系统的免疫原性和抗原性也有着很大区别，有的刺激T细胞的效率很高，有的则很难以引发免疫反应，有的虽然拥有很高的活性，但却不易与T细胞结合，比如那些没有被有效呈递的部分，T细胞就不能对它们进行有效识别。

免疫疗法是一种通过促进内源性T细胞的能力以破坏癌细胞的治疗手法，已经证明其在多种人类恶性肿瘤中的治疗效果，而T细胞对肿瘤抗原的识别过程是其中重要的一环。抗原对T细胞的免疫原性，引起免疫反应的活性强弱，是否普遍存在于所有的肿瘤细胞对最后临床治疗的效果至关重要。因此需对患者所有的肿瘤特异性抗原进行区分和筛选，选出其中最适合的一个抗原。有研究通过对免疫系统识别的那些新生抗原的效率进行分析,得到了2个结论，其一就是在大部分黑色素瘤患者中，T细胞介导的免疫系统会同时对MHC I类和MHC II类复合体上的新抗原进行反应；其二在这些癌细胞已表达的基因中，只有非常小一部分的非同义突变才能指导合成那些具有CD4+和CD8+的T细胞活性在肿瘤浸润淋巴细胞反应能被探测到的新抗原[6，13]。最近的一项通过分析成千上万的癌症基因组图谱固体肿瘤样本的研究结果表明，结合自体MHC I类分子的突变肽比预期更少见，这一观察结果与基于免疫的T细胞选择一致[14]。因此，肿瘤的抗原异质性可能解释不同患者个体对检查点封锁疗法反应的不同。那些对检查点封锁疗法有着持续反应的患者可能就是因为他们体内的肿瘤保留有足够的抗原性，使得他们对伴随癌症免疫疗法增强的免疫功能更敏感，尽管这不是由自然产生的抗肿瘤免疫反应所控制[15]。

新生抗原是源自肿瘤细胞的表达，是突变的结果，因为突变过程是不定向的，所以新抗原的形成是一个概率性的过程，那些成功表达MHCI型或II型的新抗原终究只有少数突变。再加上对于呈递出来抗原的效果的考虑，以及肿瘤成分的微环境对新抗原诱导T细胞的影响，因此每一个新抗原都来之不易。且虽然被识别的抗原很多，但是真正能够投入研究的新抗原依旧是屈指可数[1]。如2012年Castle 等[15]就黑色素瘤细胞系B16F10的DNA和RNA利用下一代测序技术寻找发生突变的氨基酸位点，563个突变位点选50个进行验证，其中只有16个可以引起免疫反应，8个能引起比较强烈的特异原肽的免疫反应。

4 新生抗原在肿瘤治疗之中的应用和价值

肿瘤治疗如此艰难，是因为在肿瘤细胞和免疫系统之间存在着一种特殊的关系，使得肿瘤细胞可以从免疫系统的监视之中逃脱。

2002年，美国肿瘤生物学家希雷伯(R.D Schreiber)提出了一个称之为“肿瘤免疫编辑”(cancer immunoediting)的假说。根据这一理论，免疫系统不但具有排除肿瘤细胞的能力，而且还具有促进肿瘤生长的作用。癌细胞在机体内发生、发展是一个免疫系统与癌细胞相互作用的动态过程。在这个过程中，免疫系统在清除一些肿瘤细胞的同时，也产生了一个选择的作用，这使得了存活下来的一些肿瘤细胞的生物学特性(如肿瘤的抗原性)进行重塑(reshape)，也即所谓的“免疫编辑”。被免疫编辑过的肿瘤细胞恶性程度越来越高，对免疫攻击的抵抗力越来越强，直至最终摧毁机体的免疫系统，造成肿瘤细胞的恶性生长并扩散[17-18]。

癌症的免疫编辑可能发生在3个阶段。首先是消除(elimination)阶段，在这一阶段中肿瘤细胞抗原性明显，先天免疫系统以及适应性免疫系统共同识别发展中的肿瘤并在它临床表现明显之前就将其消灭。如果清除过程彻底，肿瘤细胞被完全排除，免疫编辑过程就此结束。如果一些变异的肿瘤细胞逃过了免疫编辑的“清除”作用而存活下来，它们与免疫系统的关系就进入了第二种状态，即平衡(equilibration)阶段。在平衡这一阶段中剩余掩藏的没有在消除阶段被摧毁的肿瘤细胞由于免疫系统的活跃处于肿瘤休眠状态，肿瘤细胞在免疫系统的压力下，其基因有可能会发生变化，我们称其为“编辑”，这种基因突变产生的“积累效应”达到一定程度时，就可能打破平稳，使之进入到下一阶段——逃脱(escape)阶段。这一阶段受到编辑的肿瘤细胞不再被识别或是被免疫系统控制，它们开始逐步增长，诱导具有免疫抑制力的肿瘤微环境，这样之后就呈现为临床上明显的癌症。

处于逃逸阶段的肿瘤细胞在这个阶段的肿瘤细胞可以产生一系列恶性表型，如不能表达MHC分子，或不能产生肿瘤肽。失去相应的靶标，肿瘤细胞就使T细胞失去了对它的识别能力，使它逃脱了免疫杀伤。此外，肿瘤细胞会使自已的细胞凋亡信号通路发生变化，使免疫细胞诱导的肿瘤细胞凋亡机制失效。同时，肿瘤细胞快速生长形成的肿瘤会产生一个抑制免疫细胞的微环境，在这个微环境中，肿瘤细胞会释放一些具有免疫抑制功能的分子，如转化生长因子β，IL-10，等，并能诱导产生表达CTLA-4的调节T细胞，对其他免疫细胞产生抑制作用，导致免疫系统产生对肿瘤的免疫耐受。到这个阶段，免疫系统的抗肿瘤机制已全面崩溃，肿瘤生长完全失控并广泛转移。免疫编辑的终点也就是机体的死亡。因而所谓的免疫治疗就是要打破这一现状[19]。

早期的抗肿瘤药物，如烷化剂，金属铂配合物等在杀伤肿瘤细胞的同时也会大量杀伤正常细胞。随着技术的发展，各种新型的治疗方法被提出，通过针对癌症免疫逃逸的机制，阻止其免疫编辑的过程，如抗PD-1和抗CTLA-4的药物即通过阻断免疫检查点来提高免疫系统活性，而CAR-T疗法和过继细胞疗法等免疫疗法则是通过增强T细胞对肿瘤细胞的免疫反应，这些治疗方法均在癌症治疗中取得了突出的进展。如果将这些药物比作瞄准了肿瘤细胞的子弹，而新生抗原则是控制发射的开关。如何更有效地杀伤肿瘤细胞，避免对正常细胞的伤害，提高免疫系统对抗原的免疫原性，这一切都取决于抗原的优劣。

任何治疗方法的第一步都是寻找相应的靶点，一个高活性的靶点在癌症治疗中尤为关键。Neoantigen则是在其中起到了一个提供免疫系统攻击肿瘤细胞的一个重要的火力输出点。以肿瘤睾丸癌的特异性抗原NY-ESO-1为例。今年2月，Adaptimmune 旗下用于滑膜肉瘤的靶向 NY-ESO 亲和力增强型 T 细胞疗法被美国 FDA 授予突破性疗法资格。在主要的疗效分析中，10名接受目标剂量细胞治疗的患者中，有 60% 的患者产生响应，在 12 名接受任何剂量细胞治疗的患者中，总有效率为 50%～90% ，接受目标剂量细胞治疗的患者及 75% 的所有患者仍然存活。由此，新生抗原对于肿瘤治疗的作用由此可见。和其他的疗法相比，这种运用到neoantigen的免疫疗法在针对肿瘤细胞的特异性以及安全性上有着巨大的优势，治疗更精准。利用抗原抗体结合的机制，能克服肿瘤细胞通过下调MHC分子表达以及降低抗原递呈等免疫逃逸，让肿瘤细胞无所逃遁，多靶向更精准。鉴于很多肿瘤细胞表达相同的肿瘤抗原，一旦成功找到这一系列的肿瘤抗原，便可以被广泛利用，这大大增加了灭杀肿瘤的效果，同样意味着对癌症治疗效率上的飞跃以及副作用的减少。另外，在临床案例中这里同样有足够的证据表明肿瘤抗原的免疫优势，免疫系统会专注于特定的抗原以至于忽略了其他的肿瘤中存在并可检测到的抗原[20]。如果仅仅只有小部分可用新抗原就能正常地引起T细胞的反应性，那目前为止的研究分析可能低估了新抗原。

5 新生抗原与个性化治疗

2015年1月20日美国总统奥巴马宣布启动“精准医疗计划”(Precision Medicine Initiative)，随后全球范围内掀起一股精准医疗热潮。经过了第一代的非特异性免疫治疗，第二代的特异性免疫治疗，人们终于迈进第三代的精准细胞免疫治疗[21]。

精准医疗，其本质是一种更为精确的个性化医疗，非常适用于恶性肿瘤的临床治疗，具有巨大的应用前景，有望成为我国恶性肿瘤治疗的突破口。通过高通量基因测序及大数据分析，从中筛选出能高效激活免疫反应的肿瘤特异性新抗原，根据患者的主要组织相容性复合体分型，寻找能引发强烈免疫应答的新表位(neoepitopes)，获得针对癌细胞特异性新抗原(neoantigens)和针对新抗原表位具有高效应的精准T细胞，再通过扩增和过继回输治疗，诱导富集 PNA-T细胞实现对肿瘤患者进行精准免疫治疗[22]。

肿瘤，其本质上是一种由一系列基因变异的积累导致的复杂遗传疾病，这意味着肿瘤的基因组是动态变化的，且存在着高度异质性。不同的疾病进展阶段以及不同的肿瘤细胞可能携带不同的变异信息，从而对以大规模人群为基础开发和测试药物的治疗模式形成了颠覆性挑战。据一项覆盖9个国家和地区的1217例患者的结果显示：如果没有基因检测鉴定相关的靶标却接受了靶向治疗，死亡风险将增加185%。由此可以想象，为进一步提高癌症的治疗率，个性化治疗是恶性肿瘤治疗的大势所趋。

6 展望

基于近几年内研究获得的数据，新生抗原在相关疗法当中的作用已经被充分证明，从中可以预见到其巨大的发展前景。作为肿瘤细胞基因突变的产物，新生抗原在免疫系统攻击肿瘤细胞时将起到重要的靶向作用，进而为个性化的癌症免疫疗法提供了高度特异性和安全性。与普通的靶向疗法相比，这种借助自身免疫系统对肿瘤细胞进行攻击的方法无疑更为安全可靠。而如何筛选更为高效的新抗原，有选择性地提高这一免疫应答，对未来治疗干预方案的设计，是未来研究工作的重点。

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(编校：吴茜)

Recent advances of neoantigen in tumor therapy

LIU Zhi-hao, NI Shi-xin, HE Si-yuan, CHEN Shu-qingΔ

(College of Pharmaceutical Science, Zhejiang University, Hangzhou 310000, China)

As the research work went further and more detailed, a variety of new treatments compete to come out.However, it remains unclear that how the antigen works to distinguish cancer cells and normal cells. Neoantigen, which is located in the tumor cell surface of a specific antigen, its presence makes human immunotherapy into new areas which may make personalized treatment possible in the near future. Emerging data suggest that the identification of such newantigens is a major factor in clinical immunotherapy. They can form a biomarker in cancer immunotherapy to provide targets for a variety of therapeutic approaches to attack, which allows T cells to selectively enhance the immune response against this class of antigens.

neoantigen; accurate cellular immunotherapy; antigenic epitope; immune function

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.12.003

刘郅皓，男，本科，研究方向：新生抗原的肿瘤精准医疗技术，E-mail：1164728596@qq.com；陈枢青，通信作者，男，博士，教授，博士生导师，研究方向：基于基因多态性、体细胞突变和新生抗原的肿瘤精准医疗新技术研究，新型抗体药物和抗体偶联药物的设计及研究，E-mail：Chenshuqing@zju.edu.cn。

R730.51

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