苦荞发芽过程中γ—氨基丁酸的富集及其他生理指标的变化

朱云辉++段元锋++郭元新

摘要：研究苦荞在发芽期间γ-氨基丁酸（GABA）的富集及相关生理指标的变化，并对各指标间的相关性进行了分析。结果表明：随着发芽时间的延长，苦荞生长加快，呼吸作用增强，可溶性糖、还原糖、游离氨基酸含量增加；可溶性蛋白、干物质含量下降，GABA含量在发芽4 d时达到最高值，谷氨酸脱羧酶（GAD）活力呈现先增加后降低的趋势。相关性分析表明：发芽苦荞GABA的富集量与呼吸强度（r=0.794）呈显著正相关（P<0.05），与游离氨基酸含量（r=0.963）、GAD活力（r=0.879）呈极显著正相关（P<0.01），与可溶性蛋白含量（r=-0.769）呈显著负相关（P<0.05）。

关键词：发芽苦荞；γ-氨基丁酸（GABA）；富集；生理指标；相关性

中图分类号： S517.01文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）05-0332-04

苦荞[Fagopyrum Tataricum （L.） Gaertn]是一种蓼科荞麦属双子叶植物，别称鞑靼荞麦、乌麦，是我国传统的优势小杂粮，在我国西北、西南等地区有广泛种植[1]。研究表明，苦荞中的蛋白质、维生素、脂肪及矿物质含量高于大米、高粱、小麦、玉米等农作物，且含有其他禾谷类粮食所没有的芸香苷等黄酮类物质及叶绿素[2]。由于苦荞还含有蛋白酶抑制剂[3]、植酸[4]和过敏蛋白[5]等抗营养因子，其营养价值还有待改善。有研究报道：发芽处理可消解或显著降低苦荞中的抗营养成分[3，6]；通过控制发芽条件，还能够富集γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，简称GABA）等功能性成分[7-8]。

GABA是1种4碳非蛋白质氨基酸，天然分布于真核、原核生物中，主要存在于哺乳动物的脑组织、脊髓中，是哺乳动物中枢系统中1种非常有效的神经递质，参与多种代谢活动，具有重要的生理功能[9-10]。研究证实，GABA具有降血压、调节心率失常、镇定安神、调节激素分泌、预防肥胖和改善脑机能等作用[11-12]，因此，开发富含GABA的食品倍受重视。植物中GABA的合成主要通过GABA支路，此途径的限速酶为谷氨酸脱羧酶（GAD，EC 4.1.1.15）[9，13]。本研究分析了苦荞在正常发芽过程中GABA富集、谷氨酸脱羧酶（GAD）活力、呼吸强度、糖类和蛋白质等生理指标的变化，探讨其相互关系，以期为生产富含GABA的苦荞功能性食品提供理论支持。

1材料与方法

1.1试验材料

试验用苦荞品种：榆6-21，千粒质量22.4 g，2013年秋产自中国内蒙古自治区，购买后于-20 ℃冰箱贮存备用。

1.2试验试剂

GABA标准品（纯度≥99.9%）、对二甲氨基苯磺酰氯（DABS-CI，99%），购自美国Sigma公司。乙腈为色谱纯，其他化学试剂均为分析纯。

1.3主要仪器设备

LHP-160型智能恒温恒湿培养箱，上海三发科学仪器有限公司；Agilent 1200液相色谱仪，安捷伦公司；UV-1800紫外分光光度计，苏州岛津公司；KDC-160HR高速冷冻离心机，合肥科大创新股份有限公司；GZX-9076MBE型数显鼓风干燥箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；SGD-Ⅳ全自动还原糖自动测定仪，山东省科学院生物研究所。

1.4发芽试验

取30 g苦荞种子用去离子水清洗后，用1%次氯酸钠溶液消毒15 min，再用去离子水冲洗至pH值中性，在去离子水中于30 ℃浸泡4 h后，放入铺有2层滤纸的直径为9 cm培养皿中，在每个培养皿中放置约100粒种子，然后放入生化培养箱中于30 ℃暗发芽，发芽湿度为85%～90%，其间每8 h喷去离子水1次，保持种子湿润。分别培养0、1、2、3、4、5、6 d后取样，清洗后用吸水纸吸干水分，一部分用于测定芽长、GAD活性等生理指标，其余样品采用真空冷冻干燥后去壳粉碎、过80目筛测定GABA、糖类、氨基酸等物质含量。

1.5测定方法

干物质含量：用烘干恒质量法测定；芽长：随机选取30粒发芽苦荞籽粒，用游标卡尺测定其芽长；呼吸强度：用小篮子法测定[14]，以鲜质量计算CO2产生量；还原糖含量：用还原糖自动测定仪测定干质量含量；可溶性糖含量：用苯酚硫酸法测定干质量含量[14]；可溶性蛋白质含量：用考马斯亮蓝G-250法测定干质量含量，以牛血清白蛋白为标准[14]；游离氨基酸含量：用茚三酮溶液显色法测定干质量含量[14]；GAD活力：参照Zhang等方法[15]测定鲜质量活力；GABA含量：参考Guo等的方法[16]测定。

1.6统计分析

试验设3次重复，结果以“ x±s”表示。方差分析、相关性分析采用SPSS（version 16.0，Inc.，Chicago，IL，USA）软件，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2结果与分析

2.1苦荞发芽过程中芽长的变化

如图1所示，苦荞芽长随着发芽时间的延长而不断增加：发芽1 d苦荞芽长增长缓慢，仅为3.32 mm；发芽2 d后增长明显加快；发芽6 d后，芽长达到97.36 mm。

2.2苦荞发芽过程中干物质含量的变化

随着发芽时间的延长，干物质含量呈极显著的下降趋势（P<0.01）。发芽6 d时，干物质含量为24.37%，比0 d下降了63.61%（图2）；苦荞发芽时间过长，会大量消耗干物质，从而影响发芽苦荞的品质。

2.3苦荞发芽过程中呼吸强度的变化

如图3可见，在30 ℃下，苦荞的呼吸强度随着发芽时间的延长不断增强：发芽1 d内，苦荞呼吸强度增长缓慢，为 0.25 mg/（g·h），仅比0 d增加了30.69%；随后快速提升，发芽6 d时达到1.20 mg/（g·h），是0 d的6.35倍。

2.4苦荞发芽过程中还原糖含量的变化

图4显示，在苦荞发芽的前3 d，还原糖含量增长缓慢，发芽3 d仅为7.74 mg/g，是0 d的3.75倍；之后显著提升（P<0.01），在发芽5 d达到最大值，为19.88 mg/g，是0 d的9.65倍；随后缓慢下降。

2.5苦荞发芽过程中可溶性糖含量的变化

如图5所示，在苦荞发芽0～2 d内，可溶性糖含量变化不显著；2～4 d内可溶性糖含量急剧上升，发芽4 d时达到最大值，为46.89 mg/g，为0 d的2.51倍；4 d后呈现下降趋势。

2.6苦荞发芽过程中可溶性蛋白含量的变化

由图6可知，发芽前2 d，苦荞中可溶性蛋白含量显著下降（P<0.05），在发芽2 d时达到3.67 mg/g，较0 d下降了10.73%。随后可溶性蛋白呈极显著下降的趋势（P<0.01）；在6 d时含量为0.97 mg/g，较0 d降低了77.82%。

2.7苦荞发芽过程中游离氨基酸含量的变化

苦荞中游离氨基酸的含量随着发芽时间的延长呈现先增加后减少的趋势，在发芽4 d达到最高值，为578.85 μg/g，是0 d的3.74倍；随后缓慢下降（图7）。

2.8苦荞发芽过程中GAD活力的变化

如图8所示，GAD活力在发芽后急剧提升，在发芽3 d达到最高值，为40.79 U/g，是0 d的2.28倍；4 d后极显著下降（P<0.01），在发芽6 d酶活力降至26.36 U/g。GAD作为GABA合成途径的限速酶，其活力的提升有助于GABA的富集。

2.9苦荞发芽过程中GABA含量的变化

如图9所示，GABA含量随着发芽时间的延长呈现极显著的增加趋势（P<0.01），并在发芽4d达到最高值，为187.39 μg/g，比0 d增加85.35%；发芽4 d后GABA含量缓慢下降。由此可见，苦荞发芽4 d有利于GABA的富集。

2.10发芽苦荞GABA含量与生理生化指标的相关性分析

相关性分析（表1）表明，发芽苦荞GABA的富集量与呼吸强度（r=0.794）呈显著正相关（P<0.05）；与游离氨基酸含量（r=0.963）、GAD活力（r=0.879）呈现极显著正相关（P<0.01）；与可溶性蛋含量（r=-0.769）呈显著负相关（P<0.05）。

3讨论

已有报道证明，植物中的GABA合成主要来自GABA支路中由GAD催化的不可逆的α-谷氨酸脱羧反应[9]。植物种子经浸泡发芽后，GAD大量合成，GABA量随之增加[17]。本研究表明：GABA富集量与GAD活力呈极显著正相关（P<0.01），苦荞在发芽前4 d，GABA富集量、GAD活力均不断提升；发芽4 d后，GAD活力下降，GABA含量也呈下降趋势。

发芽过程实质上是一个酶促反应的过程，种子经浸泡发芽后，呼吸速率加快，淀粉酶和蛋白酶等水解酶被迅速激活，贮藏物质降解，干物质含量下降，为呼吸、GABA合成等生理活动提供了充足的底物[18-20]。苦荞在发芽过程中，淀粉被分解为小分子糖类，还原糖和可溶性糖含量不断升高，但在发芽4～5 d后呈现下降趋势，这可能是由于淀粉被分解的速率低于还原糖、可溶性糖消耗的速率所致。可溶性蛋白含量与游离氨基酸含量呈显著负相关，且均与呼吸强度呈现极显著相关性，随着苦荞的生长，蛋白酶活性增强，呼吸强度提升，其氮代谢随之加剧，大分子的蛋白质分解为游离氨基酸，其组成更表1苦荞发芽过程中生理活性和GABA等物质含量的相关性分析结果

指标芽长干物质含量呼吸强度可溶性糖含量可溶性蛋白含量游离氨基酸含量GAD活力干物质含量-0.969**呼吸强度0.945**-0.979**可溶性糖含量-0.642-0.7040.826*还原糖含量0.937**-0.937**0.960**0.824*可溶性蛋白含量-0.949**0.963**-0.992**—游离氨基酸含量0.733-0.867*0.902**—-0.870*GAD活力0.220-0.4340.482—-0.4180.790*GABA活力0.595-0.7500.794*—-0.769*0.963**0.879**注：“*”表示在0.05水平上显著，“**”表示在0.01水平上显著，“—”表示不存在或无需关注其相关性。

加合理，提高了种子的营养价值。研究者们对发芽的大豆[21]、糙米[22]和蚕豆[23]的研究均表明，GABA的富集量与氨基酸含量呈显著正相关。在本研究中，苦荞的GABA含量与游离氨基酸呈现极显著的正相关；此外，大分子的可溶性蛋白不断下降，与GABA含量呈显著负相关，这些变化有利于 GABA 的富集。

4结论

苦荞发芽过程中各生理指标均发生了显著的变化（P<0.05）。苦荞芽长不断生长，呼吸作用加快，干物质含量降低，还原糖含量在发芽5 d达到最高值，随后不断下降，可溶性糖含量先下降后上升再下降，可溶性蛋白含量不断下降，游离氨基酸含量不断增加并在发芽4 d达到最高值。GAD活力呈现先增加后降低的趋势，GAD活力的提升促进了GABA的富集，在发芽4 d时GABA含量达到最高值，为187.39 μg/g，与发芽0 d相比增加了85.35%。相关性分析表明：发芽苦荞GABA的富集量与呼吸强度（r=0.794）呈显著正相关（P<0.05），与游离氨基酸含量（r=0.963）、GAD活力（r=0.879）呈极显著正相关（P<0.01），与可溶性蛋白含量（r=-0769）呈显著负相关（P<0.05）。

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