抗体药物偶联物临床前安全性评价策略

洪 敏，赵小平，马 璟（1.国家上海新药安全评价研究中心，上海 201203；2.上海益诺思生物技术有限公司，上海 201203）



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抗体药物偶联物临床前安全性评价策略

洪 敏1，2，赵小平1，2，马 璟1，2
（1.国家上海新药安全评价研究中心，上海 201203；2.上海益诺思生物技术有限公司，上海 201203）

马 璟，研究员、博士研究生导师，主要从事药理学及药物毒理学研究，现任国家上海新药安全评价研究中心主任。兼任国家食品药品监督管理总局药品审评专家及GLP检查专家、环境保护部化学物质环境管理评审专家委员会评审专家、中国毒理学会第六届理事会常务理事兼副秘书长、中国毒理学会药物毒理与安全性评价专业委员会副主任以及该会药物毒理专业委员会主任。先后承担国家863、国家创新药重大专项等20多项课题研究任务，发表论文50多篇，部分成果达到了国际先进水平。带领所在的安评中心发展成为国内为数不多的、同时通过美国和欧盟GLP等多项国际认证的新药临床前安评机构。迄今已带领该安评中心为国内外140余家新药研发机构提供过2700多项安评服务。

摘要：抗体药物偶联物（ADC）是近年来肿瘤治疗研究中的热点问题。临床上ADC药物在增强药效作用的同时，还极大减小毒副作用，因而前景良好。但该类药物组成相对复杂，且临床前安评经验积累较少，为安评带来挑战。本文通过分析ADC药物的作用方式、主要的毒性风险和临床前/临床试验中常见毒性，同时研究已批准ADC药物毒性试验，结合ICH S6（生物技术药物临床前安全性评价）和ICH S9（抗肿瘤药物研究及评价）指导原则，探讨ADC药物的临床前安评策略。

关键词：抗体药物偶联物；安全性评价；肿瘤；分子靶向治疗

DOl：10.3867/j.issn.1000-3002.2016.01.002

抗肿瘤药物是当前药物研究的热点。肿瘤的手术治疗或放射治疗往往比较局限，化疗是转移性肿瘤常规治疗手段，但其在杀灭肿瘤细胞的同时，化疗药物对增殖较快的正常细胞也存在杀伤作用，因而存在较大的系统毒性，严重限制药物的使用。因此，靶向治疗在肿瘤治疗的研究中受到越来越多的关注。抗体药物偶联物（antibody-drug conju-gates，ADC）可作为靶向治疗药物，减少毒性化合物的用量，并作用于特定结构位点，降低系统暴露，从而达到减毒增效的作用。

自1974年ADC概念提出后，随着单克隆抗体和鼠源性、人鼠嵌合抗体在20世纪80年代临床试验的成功，ADC药物开发逐渐成为可能［1］。2001年FDA批准首例ADC药物〔抗CD3抗体吉妥珠单抗（gemtuzumab）+奥佐米星（ozogamicin）〕（Mylotarg）用于临床（于2010年撤市）；随后又有2种药物也在临床上成功使用，一种是昔单抗凡酯（brentuzusmab vedotin）（Adcetris）用于治疗霍奇金淋巴瘤，另一种是阿多曲妥珠单抗依酯T-DM1（ado-trastuzumab em-tansine）（Kadcyla）用于治疗人表皮生长因子受体2高表达的乳腺癌。目前，全球已经有＞100项的ADC药物临床试验正在进行。随着国际上ADC药物应用的成功，国内ADC药物的研究也取得可喜的成绩，目前已有部分ADC药物完成临床前评价，且更多的药物正在研究中。ADC药物作为近年来发展起来的一类靶向治疗药物，大大降低毒性风险的同时，因其特殊的结构和作用方式，也给临床前安评带来挑战。

1　ADC药物的结构及作用方式

ADC药物是采用特定的连接子将抗体和小分子细胞毒药物连接起来，其主要组成成分包括抗体、连接子和小分子细胞毒药物（small molecular cytotoxic drug，SM）。抗体分子主要发挥靶向投递作用，小分子药物发挥效应。但有些抗体同时存在抗肿瘤的药效学作用，如Kadcyla中阿多曲妥珠单抗（ado-trastuzumab）和美坦新（maitansine）（美登素）存在协同作用。

ADC药物作用方式主要为：①循环，ADC药物采用系统暴露的方式给药，首先进入血液系统，由于抗体相对分子质量约为150 ku，而细胞毒药物相对分子质量约为1 ku，ADC药物循环中的性质基本与“裸”抗体一致。②结合抗原，抗体识别特异性的抗原位点，该过程将决定靶向投递的特异性。③内化，抗体与细胞膜上受体结合后，发生内吞。④药物释放，连接子在细胞内溶酶体中裂解，释放出小分子细胞毒药物。⑤发挥药物作用，小分子细胞毒药物发挥作用，杀伤肿瘤细胞［2］。

除上述常见的ADC药物设计以外，有些ADC药物设计不进行内化，而在胞外释放，在局部微环境发挥作用。

由于ADC药物结构较为复杂，且不同ADC药物设计之间存在较大的差异。即使同一靶点的不同药物，由于识别位点、连接位点、连接子及所连接小分子的不同，其毒性的差异显而易见。因此，评价ADC药物毒性之前，先要了解该ADC药物的设计。理想的ADC药物设计需要考虑①抗体的选择：靶点清晰、肿瘤细胞高表达，正常组织低表达；支持药物加载、稳定、能向细胞内化；良好的PK特性；非特异性结合少；②连接位点：一般有赖氨酸或半胱氨酸残基，可改构进行定向偶联；③连接子：在循环中稳定，在细胞内能被释放（如在溶酶体内酶切释放，或抗体降解后释放）；④细胞毒药物：高度的药效学作用，无免疫原性，通过修饰能与连接子结合，机制清晰［3］。

2　ADC的毒性风险

2.1抗体分子

目前，ADC药物的抗体分子常采用人源化单抗，对可结晶片段（crystaliable fragment，Fc）段进行修饰，以降低抗体依赖性细胞介导细胞毒性（anti-body-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）和补体依赖性细胞毒性（complement dependent cytotoxicity，CDC）等。首先抗体分子作为生物大分子，存在一般生物大分子的毒性风险，如免疫原性和免疫毒性，以及单抗可能的ADCC作用、CDC作用、肾基底膜免疫复合物沉积等。其次，在ADC药物中，抗体分子最重要的作用是靶向作用，即将小分子化合物定向投递到抗原抗体结合位点。如果抗体选择性较差或正常组织存在该抗原，则会造成细胞毒药物投递到正常细胞中，造成靶向毒性。由于ADC药物靶向性较强，会造成严重的毒性后果。如Jijink等［4］关于抗-CD44v6比代珠单抗（bivatuzumab）+美坦新临床试验报道中，该药物用于治疗头颈部或消化道的难治性鳞状细胞癌，但CD44v6在正常皮肤中有表达，患者每周1次给予该药100和120 mg·m-2，各有1名患者出现皮肤毒性（CD44v6靶点）。高剂量下（140 mg·m-2），1名患者在给药2次后皮肤坏死并导致死亡，直接导致该药物终止开发［4］。第三，除靶向毒性外，循环过程中的小分子脱落可导致一定程度的脱靶毒性。抗体分子的Fc如存在与免疫细胞Fc受体如FcγRs/ FcRN结合的活性，易与免疫细胞结合，造成免疫细胞的杀伤。最后，ADC药物做为外源性生物大分子，还可能在循环中吞噬细胞，通过胞饮作用进入胞内造成细胞死亡。

2.2连接子

ADC药物常用的连接子主要包括腙键、二硫键和肽键。腙键在酸性条件下即可发生水解，是相对不稳定的连接子。Mylotarg即采用腙键作为连接子，研究人员认为这是导致Mylotarg失败的一个重要原因［2］。二硫键在细胞内高浓度的谷胱甘肽中可发生水解，因此不易在胞外脱落。肽键的结合最为紧密，仅在溶酶体蛋白水解酶的作用才发生断裂［5］。连接子的稳定性直接影响细胞毒药物的非预期解离情况，这种断裂造成小分子细胞毒药物在体内的暴露，即脱靶毒性。

2.3细胞毒药物

细胞毒药物为临床上常规使用的化疗药物，决定ADC药物主要的毒效应谱。由于已在临床上广泛使用，其毒性特征一般都比较清楚。根据药物类型如微管蛋白聚合抑制剂或DNA损伤剂即能较好地把握其毒性风险。

2.4ADC分子

在抗体和小分子细胞毒药物通过连接子整合成一个整体后，①药物抗体比（drug∶antibody ratio，DAR）能明显影响ADC药物的毒性。一般认为每个抗体上结合2～4个毒性化合物的治疗窗最大。如DAR过低，则抗体携带的效率较低；反之，如DAR过高，机体易将其识别为异物从而快速清除。②当前的ADC药物一般为不同DAR的混合物，由于不同DAR所致的毒性不一致，DAR的异质性将导致毒性的不确定。这种DAR混合物中还可能有未结合至抗体的细胞毒药物，造成脱靶毒性。③由于在抗体上增加连接子和小分子细胞毒药物，可能造成抗体聚合、裂解、空间结构等变化，从而使抗体表现出与裸抗体不一致的特性，导致非预期的毒性。

2.5ADC药物常见毒性

FDA对收到的20个ADC研究中新药（invesli-gational new drugs，IND）进行汇总分析，发现ADC药物在动物中表现出来的毒性主要为造血系统毒性、肝毒性和生殖毒性，部分还存在皮肤毒性和肾毒性。其中造血系统、肝和生殖系统的毒性与小分子细胞毒药物直接相关，而肾毒性可能是抗体所致的免疫反应的继发性损伤［6］。

已批准上市的药物如Adcetris和Kadcyla临床上的不良反应主要为小分子细胞毒药物引起的骨髓抑制相关作用（中性粒细胞减少、败血症和出血）、肝毒性和肾毒性。此外，还有部分患者出现注射相关的毒性，可能与给予大分子蛋白成分有关［6-7］。

3　已完成的ADC临床前药物安全性评价［8-10］

FDA批准上市的3例ADC药物中，Mylotarg在2001年批准上市，由于上市后风险收益比较小，已在2010年撤市。近年来批准的Adcetris和Kadcyla所完成的临床前安评实验具有一定的参考价值，也为后续ADC药物开发中的毒性评价提供了方向。

3.1Adcetris

Adcetris是由Seattle Genetics公司开发用于治疗霍奇金淋巴瘤的ADC药物，由CD30特异性抗体布妥昔单抗+单甲基金抑素（奥利斯他汀）E （monomethyl auristain E，MMAE）通过缬氨酸-瓜氨酸连接而组成。所完成的临床前安评试验见表1。

该公司在临床前对Adcetris及MMAE均进行单次给药毒性和重复给药毒性实验，目的在于发现Adcetris的毒性，以及判断这种毒性是否由MMAE所造成。FDA尚未审核单次给药毒性实验报告，可能因为同时进行了MMAE重复给药毒性实验。其重复给药毒性实验指标包括体质量、临床观察、摄食量、临床病理学检查、眼科检查、体格检查、神经系统指标、心电图、毒代动力学、免疫原性和免疫毒性、大体病理学、组织病理学评价。Herg实验和遗传毒性实验均未采用大分子ADC药物，仅对小分子细胞毒药物MMAE进行评价。进行了探索性的生殖毒性实验，结果显示可能存在Ⅱ段生殖毒性。

3.2Kadcyla（T-DM1）

Kadcyla是由Roche公司开发用于治疗HER2高表达乳腺癌的ADC药物，所含的两种成分通过二硫键相连接。所完成的临床前安评实验见表2。

Roche在临床前主要对Kadcyla进行单次给药毒性和重复给药毒性实验。虽然DM1是临床上广泛使用的药物，其毒性较为清楚，但应FDA要求，补充进行了DM1的单次给药毒性实验，以确定其毒效应谱，并分析T-DM1重复给药毒性实验毒性是否由DM1造成。其重复给药毒性实验指标包括体质量、临床观察、摄食量、临床病理学、眼科检查、体格检查、神经学检查、ECG、毒代动力学评价、免疫原性和免疫毒性、大体病理学、组织病理学。Herg和遗传毒性实验均采用小分子细胞毒药物DM1，临床前实验中未进行生殖毒性评价。

4　ADC药物安全性评价中毒理学实验设计［11］

4.1指导原则

目前尚无针对ADC药物的指导原则，由于ADC既是生物大分子，又存在小分子细胞毒作用。临床前安评参考ICH S6（生物技术药物临床前安全性评价）及其ICH S6附录［12-13］，评价小分子细胞毒化合物采用ICH S9（抗肿瘤药物研究及评价指导原则）［14］。为满足安评，至少应完成安全药理实验、组织交叉实验、单次给药毒性实验、重复给药毒性实验和毒动学实验［15］。根据ICH S9无需特别关注生殖毒性和遗传毒性，但需注意细胞毒药物存在该方面风险。如进行遗传实验和体外Herg实验，则仅评价小分子细胞毒药物。

表2　Kadcyla临床前完成的毒性实验及结果

4.2动物种属选择

安评一般要求两个相关动物种属，ADC分子代谢特征主要为大分子抗体，相关动物种属的确定需根据组织交叉反应，如仅1个动物种属存在组织交叉，则仅用该种属进行实验，不相关的种属易遗漏或误导药物的毒性。小分子细胞毒药物则根据已有的毒理学实验或其毒性机制确定动物种属，至少在1个种属上评价小分子细胞毒药物的毒性，以确定其毒性是否与上市药物一致，同时判断ADC药物所致的毒性是否主要由细胞毒药物造成。国内部分研究人员则在ADC重复给药毒性实验中设置一个组别，同时给予小分子化合物。

4.3剂量/给药周期及毒理学终点设置

由于ADC药物的系统暴露主要由抗体分子决定，因此剂量和给药周期设计一方面需考虑药效学剂量，另一方面则根据抗体分子代谢特征。按照具体问题具体分析的原则进行设计。

选择毒理学终点时，除应包含一般的毒理学评价终点如体质量、摄食量、临床观察、临床病理学和眼科检查、体格检查、体温、心电图、大体病理学、组织病理学外，还需设置免疫原性和免疫毒性指标，如抗药物抗体、免疫球蛋白、免疫细胞表型、补体和免疫组织化学检查等。

5　ADC药物的药代/毒代动力学研究

抗体是ADC药物的主要组成成分，其主要药代动力学特征与裸抗体类似，即清除率和表观分布容积较低、半衰期较长、可能存在免疫原性等［16］。但由于在抗体结构基础上引入了效应分子，需分析的成分更为多样，同时ADC药物往往是不同DAR的混合物，使得ADC药物的药代动力学研究更为复杂［17］。为评价其药代动力学，要对总抗体（ADC+游离抗体）、总ADC、游离药物进行检测［18］。此外，由于ADC药物往往存在免疫原性，进行药代动力学研究时尚需检测抗药物抗体，以对其暴露量进行合理评价［19-20］。

6　新型ADC药物的安全性评价

多数ADC药物采用已知的抗体及小分子药物，但今后发展的新型小分子细胞毒药物也将出现在ADC药物中［21］，这些未经临床验证的小分子化合物由于毒性不明确，需按照ICH S9单独完成安评。

此外，由于ADC药物连接子技术的发展，目前已能采用定点偶联技术，通过引入反应性半胱氨酸或非天然氨基酸，完成ADC分子中抗体与小分子药物的连接。该技术能形成均一DAR的ADC药物，克服传统连接子的脱落、聚沉，并较好地保留抗体分子的特性［22-24］。对于这类较为稳定的ADC药物，也需完成上述安评，但其毒性更易掌控。

7　结语

ADC药物是近年来快速发展的抗肿瘤药物，目前尚无针对性的指导原则，临床前安评积累的经验尚不足，而更多新型ADC药物的出现也给安评带来挑战，同时也给肿瘤治疗带来光明。Teicher［25］对ADC药物的靶点进行综述，CD19，CD20，CD22，CD25，CD30，CD33，CD40等35个靶点可作为ADC药物抗原。随着ADC药物在肿瘤治疗中的应用越来越广，临床前安评策略也将逐渐成熟。

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（本文编辑：齐春会）

Strategy of antibody-drug conjugates in preclinical safety evaluation

HONG Min1，2，ZHAO Xiao-ping1，2，MA Jing1，2
（1.National Center for New Drug Safety Evaluation and Research in Shanghai，Shanghai 201203，China；2.Shanghai Innostar Biotechnology Co.Ltd.，Shanghai 201203，China）

Abstract：Recently，increasing cancer researches focus on antibody-drug conjugates（ADCs）which can improve the anti-tumor potency with less adverse effect while benefiting patients in the future.However，safety evaluation of ADCs is a big challenge because of complex components as well as in experience in preclinical studies.In this review，the authors reviewed the mode of action，hazard risks，and toxicity observed in preclinical/clinical studies of ADCs，summarized the preclinical studies of Adcetris（brentuximab vedotin）and Kadcyla（ado-trastuzumab emtansine），and suggested a better strategy of ADCs in preclinical safety evaluation.

Key words：antibody-drug conjugates；safety evaluation；tumors；molecular targeted therapy

中图分类号：R967

文献标志码：A

文章编号：1000-3002-（2016）01-0007-06

Foundationitem：TheprojectsupportedbyNationalScienceandTechnologyMajorProjectofChina（2012ZX09302002）Corresponding author：MA Jing，E-mail：jma@ncdser.com

收稿日期：（2015-12-13接受日期：2015-12-17）

基金项目：国家科技重大专项（2012ZX09302002）

通讯作者：马 璟，E-mail：jma@ncdser.com