血管细胞黏附分子-1过表达对小鼠间充质干细胞迁移能力的影响

程 岩，朱 恒，刘元林，王艳国，赵 岳，陈秀慧，杨振林，张 毅（.滨州医学院附属医院甲状腺乳腺外科，山东滨州 5660；.军事医学科学院基础医学研究所，北京00850；.内蒙古包头医学院病理生理学教研室，内蒙古包头 0060；.空军总医院妇产科，北京00）



血管细胞黏附分子-1过表达对小鼠间充质干细胞迁移能力的影响

程 岩1，2，朱 恒2，刘元林2，王艳国3，赵 岳4，陈秀慧2，杨振林1，张 毅2
（1.滨州医学院附属医院甲状腺乳腺外科，山东滨州 256603；2.军事医学科学院基础医学研究所，北京100850；3.内蒙古包头医学院病理生理学教研室，内蒙古包头 014060；4.空军总医院妇产科，北京100142）

摘要：目的 探讨血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）过表达对小鼠间充质干细胞（MSC）迁移能力的影响，并初步探讨其作用机制。方法 将正常小鼠MSC（C3）、转染空载体的小鼠MSC（C3+N）和基因修饰过表达VCAM-1的小鼠MSC（C3+VCAM-1）分别接种在Transwell培养体系培养8和12 h，以胎牛血清为趋化物质诱导MSC迁移。甲紫（结晶紫）和DAPI染色法观察并计数各组细胞的迁移细胞数和迁移率。利用丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路抑制剂〔SB203580，PD98059和Jun激酶（JNK）抑制剂Ⅱ〕阻断细胞活化的信号通路，观察各组MSC迁移能力的改变。结果 MSC在Transwell体系培养8和12 h，C3+VCAM-1组细胞迁移数分别为7467±485和8795±255，迁移率分别为（14.9±1.0）%和（17.6±0.5）%，均显著高于C3组〔2731±562和4779±224；（5.5±1.1）%和（9.6±0.4）%〕和C3+N组〔2539±321和5645±1080；（5.1± 0.6）%和（11.3±1.1）%〕（P＜0.05，P＜0.01）。加入JNK抑制剂Ⅱ可抑制MSC的迁移能力，C3+VCAM-1组迁移的细胞数为4843±167，迁移率为（9.7%±0.3）%，显著低于不加JNK抑制剂Ⅱ的C3+VCAM-1组（P＜0.01）。MAPK通路抑制剂SB203580和PD98059对MSC的迁移能力无抑制作用。结论 VCAM-1过表达可能通过活化JNK/MAPK通路促进小鼠MSC的体外迁移作用。

关键词：血管细胞黏附分子-1；间充质干细胞；细胞迁移

DOl：10.3867/j.issn.1000-3002.2016.01.010

间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）是属于中胚层的一类多能干细胞。它不仅具有多向分化潜能，而且还能通过机体调控，广泛迁移到多种组织，参与组织细胞的更新和修复，维持机体的形态完整性和功能稳定性［1］，因此，MSC是细胞治疗理想的种子细胞之一。但MSC通过静脉注射向受损靶器官的迁移率较低［2］，这在很大程度上影响了MSC的组织修复能力，如何提高MSC的靶向迁移是将MSC应用于细胞治疗过程中亟待解决的问题。

正常组织中的MSC功能性表达某些趋化因子受体和黏附分子，血管细胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）是其中的成员之一，它是一种细胞表面黏附分子，可使循环血液中的MSC被血管内皮细胞捕获，并最终穿越细胞屏障进入并重建损伤组织的结构和功能［3］。有文献报道，VCAM-1是MSC免疫功能的重要调控因子［4］，在机体发生炎症反应时，MSC会有VCAM-1暂时性表达升高［5］，以此促进MSC向炎症组织的迁移。因此，通过调节VCAM-1的表达水平以激发MSC迁移潜能可能是促进活体组织修复的一种有效的途径。

本研究通过基因修饰的方法在MSC中过表达VCAM-1，探讨其对MSC迁移作用的影响。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activation protein kinase，MAPK）通路是调控细胞增殖分化和迁移的重要信号通路。本研究采用MAPK通路抑制剂探讨VCAM-1过表达对MSC迁移能力的影响，以期深入认识MSC迁移及可能的作用机制。

1　材料与方法

1.1细胞、试剂和主要仪器

MSC细胞（C3H10T1/2），美国ATCC公司。α-MEM、优级胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、牛血清白蛋白（bovine serum albumn，BSA）和胰酶，均购自美国Gibco公司；MAPK信号通路中P38蛋白抑制剂SB203580（SB）、细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）抑制剂PD98059（PD）和Jun激酶（Junkinase，JNK）抑制剂Ⅱ，均购自德国Merck公司；DAPI和甲紫，世纪康为公司；培养瓶，美国Corning公司；Transwell板，美国Millipore公司。TI-S荧光显微镜，日本Nikon公司。

1.2Transwell培养体系检测MSC的体外迁移能力

1.3不同染色方法计算MSC迁移数和迁移率

1.3.1DAPl染色法

从Transwell培养体系中取出培养小室，PBS溶液洗2次后用无菌棉棒轻轻擦去贴附于培养小室膜上的细胞，4%多聚甲醛室温固定20 min，PBS溶液洗2次，将培养小室放入含有0.2 mg·L-1DAPI 的PBS溶液中，室温作用30 min，荧光显微镜下孔随机选取6个视野并照相。

1.3.2甲紫染色法

将培养小室细胞用PBS溶液洗2次，风干后用0.1%甲紫染液染色30 min，PBS溶液洗2次，光镜下每孔随机选取6个视野计数并照相。以每孔细胞计数平均值表示细胞迁移数。

1.4MAPK通路抑制剂对MSC体外迁移影响的测定

实验所用MAPK通路抑制剂为SB 600 nmol·L-1， PD 2 μmol·L-1和JNK抑制剂Ⅱ90 nmol·L-1。实验分为4组，即FBS组、FBS+SB组、FBS+PD组和FBS+JNK抑制剂Ⅱ组。每组均包括3种细胞，即C3，C3+N和C3+VCAM-1，每组3复孔。

在Transwell小室上腔中加入200 μL无血清α-MEM润膜1 h，而后加入200 μL细胞悬液至小室上腔，通过间隙分别向下腔加入600 μL含不同抑制剂的血清趋化培养液，即FBS组（0.5%FBS+ α-MEM），FBS+SB组（0.5%FBS+α-MEM+SB），FBS+PD组（0.5%FBS+α-MEM+PD），FBS+JNK抑制剂Ⅱ组（0.5%FBS+α-MEM+JNK抑制剂Ⅱ）。将细胞放入CO2培养箱中12 h，DAPI和甲紫染色，计数迁移细胞，方法同前。

对照组护理人员的常规操作评分、健康宣教评分以及无菌操作评分低于实验组，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表1。

1.5统计学分析

2　结果

2.1VCAM-1过表达对MSC迁移能力的影响

将过表达VCAM-1的MSC（C3+VCAM-1）、转染空载体的MSC（C3+N）和正常未转染的MSC （C3）在Transwell体系中分别培养8和12 h后，DAPI（图1A）和甲紫（图1B）染色法观察细胞迁移情况。结果显示，两种染色方法在镜下均可见细胞从Transwell小室底部穿出。培养8 h后，C3+ VCAM-1组细胞迁移数较C3组和C3+N组有所增多。培养12 h后，镜下可见C3+VCAM-1组迁移细胞数较C3和C3+N组显著增多。

将在Transwell体系中培养8和12 h的细胞用甲紫染色后，计算细胞迁移率。表1结果表明，培养8 h后C3+VCAM-1组细胞迁移率显著高于C3和C3+N组（P＜0.01）。培养12 h亦得到相同的结果，即C3+VCAM-1组细胞迁移率较其他两组显著升高（P＜0.01）。上述结果提示，无论培养8 h还是12 h，转染VCAM-1基因可显著提高MSC的迁移能力。

2.2MAPK通路抑制剂对MSC迁移能力的影响

将MAPK通路抑制剂SB，PD和JNK抑制剂Ⅱ（终浓度分别为600 nmol·L-1，2 μmol·L-1和90 nmol·L-1）加入Transwell培养体系的3种细胞，以正常血清培养的MSC为对照组，经12 h培养后进行甲紫染色，计算细胞迁移率。表2和图2结果显示，只加FBS的C3+VCAM-1组细胞迁移率较C3组和C3+N组显著增高（P＜0.05）。FBS+SB组和FBS+

Fig.1Observation of mesenchymal stem cells（MSCs）migrated into lower chamber of Transwell after being cultured for 8 and 12 h，respectively.C3：normal mouse MSC；C3+N：empty vector-transfected MSC；C3+VCAM-1：VCAM-1 transfected MSC.A：DAPI staining；B：methylrosanilium chloride（crystal violet）staining.Bar=100 μm.

Tab.1 Quantification of transmigrated cells detected by crystal violet staining

PD组的细胞迁移情况较相应FBS对照组无显著改变。而FBS+JNK抑制剂Ⅱ组的3种细胞迁移能力均较FBS对照组明显减弱，以C3+VCAM-1组细胞的迁移能力下降最为显著，细胞迁移率较对照组明显降低（P＜0.01）。此结果提示，JNK抑制剂Ⅱ抑制C3+ VCAM-1细胞的迁移能力。

DAPI染色结果见图3，迁移细胞计数结果与甲紫染色计数结果一致（数据略）。提示，高表达VCAM-1对MSC迁移作用的影响与JNK/MAPK通路有关。

Tab.2 Transmigrated cells inhibited by mitogen-activation protein kinase（MAPK）inhibitors detected by crystal violet staining

Fig.2 Effect of MAPK pathway inhibitors SB，PD and JNK inhibitorⅡon migration of MSCs detected by crystal vio-let staining.See Tab.2 for the cell treatment.Data were representative of three independent experiments.Bar=100 μm.

Fig.3 Effect of MAPK pathway inhibitors SB，PD and JNK inhibitorⅡon migration of MSC detected by DAPl staining. See Tab.2 for the cell treatment.Data were representative of three independent experiments.Bar=100 μm.

3　讨论

影响MSC迁移的因素有很多，主要包括组织损伤或炎症反应中产生的多种生长因子和趋化因子，以及黏附分子和Toll样受体等［7-9］。FBS中富含各种生长因子和趋化因子。为此，本研究以低浓度FBS作为趋化物，模拟体内多种趋化因素对MSC迁移的影响。预实验结果表明，0.5%FBS可有效诱导MSC体外迁移。

MSC迁移的调控机制错综复杂，既有因MSC来源、靶组织器官种类及损伤性质不同而不同的调控机制，也有信号转导通路的调控。因此，目前对于MSC迁移的确切调控机制尚不清楚。近年来研究发现，MSC迁移不仅与MAPK、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/Akt及蛋白激酶C等途径有关，而且与作用的细胞因子有关，不同的细胞因子引起MSC迁移的信号机制也有差异［9-11］。研究血小板衍生生长因子（platelet-deriyed growth factor，PDGF）家族对MSC迁移作用的影响，发现PDGF-BB对脂肪来源的MSC迁移和增殖都有不同程度的影响。利用JNK通路抑制剂处理后，MSC的迁移被抑制；而P38和ERK通路被抑制后，MSC的迁移却未受影响［12］。最近研究发现，PDGF-BB能通过PI3K，P38 MAPK和NF-κB通路提高VCAM-1的表达，从而介导MSC的迁移［13］。

VCAM-1即CD106，是介导细胞间识别与黏附的重要分子，参与调节机体免疫应答细胞和组织的分化和发育，与淋巴细胞归巢再循环及肿瘤恶化和转移等密切相关［14-15］。VCAM-1具有可诱导性、细胞表达特异性及生物学作用多样性等特点，临床意义十分广泛，但VCAM-1是否在MSC向靶组织器官的迁移中发挥作用，目前尚无定论。本研究结果表明，在Transwell模型体系中，过表达VCAM-1的MSC（C3+VCAM-1）迁移能力较正常MSC组（C3）和转染空载体的MSC组（C3+N）显著增强。对这一现象的相关机制进行初步探讨，即将MAPK通路抑制剂SB，PD和JNK抑制剂Ⅱ分别加入培养体系。结果表明，加入P38和ERK抑制剂SB和PD后，过表达VCAM-1的MSC迁移能力较未加抑制剂的对照组无明显变化。而加入JNK抑制剂Ⅱ后，3种MSC的迁移能力均有不同程度减弱，其中过表达VCAM-1的MSC即C3+VCAM-1组迁移能力减弱最为明显。由此可见，JNK抑制剂Ⅱ能抑制MSC的迁移，其作用靶点可能是VCAM-1分子。

上述实验结果提示，VCAM-1可能通过JNK信号通路促进MSC的迁移。这为从全新的角度研究VCAM-1提示了新的思路，也为MSC的靶向治疗提供了新途径。

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（本文编辑：齐春会）

Effect of overexpression of vascular cell adhesion molecule-1 on migration of murine mesenchymal stem cells

CHENG Yan1，2，ZHU Heng2，LIU Yuan-lin2，WANG Yan-guo3，ZHAO Yue4，CHEN Xiu-hui2，YANG Zhen-lin1，ZHANG Yi2
（1.Department of Thyroid and Breast Surgery，Affiliated Hospital of Binzhou Medical College，Binzhou 256603，China；2.Institute of Basic Medical Sciences，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100850，China；3.Department of Pathophysiology，Baotou Medical College，Baotou 014060，China；4.Department of Obstetrics and Gynecology，Air Force General Hospital，Beijing 100142，China）

Abstract：OBJECTlVETo investigate the effect of overexpression of vascular cell adhesion molecule-1（VCAM-1）on the migration in vitro of the murine mesenchymal stem cells（MSCs）and its possible mechanism．METHODS The migration ability of normal mouse MSC（C3），empty vectortransfected MSC（C3+N）and VCAM-1 transfected MSC（C3+VCAM-1）was assessed by Transwell culture system in vitro after incubation for 8 and 12 h，respectively．The fetal bovine serum（FBS）was used as the chemotactic agent to induce MSC migration．The transmigrated cells were detected with methylosaniliam chloride（crystal violet）as well as DAPI staining．Furthermore，the specific chemical inhibitors of mitogen-activation protein kinase（MAPK）pathway（SB203580，PD98059 and JNK inhibitorⅡ）were added to the Transwell system for 12 h and the alteration of the MSC migration ability was evaluated．RESULTS After incubation with FBS for 8 and 12 h，the absolute migrated cell number（7467±485 and 8795±255）and migration rate〔（14.9±1.0）%and（17.6±0.5）%〕of MSC in C3+VCAM-1 group were significantly increased compared with C3 group〔2731±562 and 4779±224，（5.5±1.1）%and（9.6±0.4）%〕and C3+N group〔2539±321 and 5645±1080，（5.1±0.6）%and（11.3± 1.1）%〕（P＜0.05，P＜0.01），but there was no significant difference between C3 and C3+N groups. Moreover，the MSC migration ability of C3+VCAM-1 group was partially suppressed by addition of JNK inhibitorⅡ.The transmigrated cell number（4843±167）and migration rate〔（9.7±0.3）%〕were decreased compared with those of C3+VCAM-1groupwithout JNK inhibitorⅡ（P＜0.01）.SB203580 and PD98059，as specific chemical inhibitors of MAPK pathway，had no effect on MSC migration.CONCLUSlON VCAM-1 can enhance mouse MSC migration in vitro and th4e mechanism may be related to JNK/MAPK pathway activation.

Key words：vascular cell adhesion molecule-1；mouse mesenchymal stem cells；cell migration

中图分类号：R971

文献标志码：A

文章编号：1000-3002（2016）01-0068-06

Foundation item：The project supported by National Natural Science Foundation of China（31070996）；National Natural Science Foundation of China（31171084）；National Natural Science Foundation of China（81371945）；National Natural Science Foundation of China（81101342）；Major Basic Research Development Program of China（973 Program）（2010CB833600）；and Natural Science Foundation of Beijing City（7132133） s：ZHANG Yi，Tel：（010）66930315，E-mail：zhangyi612@hotmail.com；YANG Zhen-lin，Tel：（054）3258768，E-mail：yzhlin@126.com

收稿日期：（2015-03-11接受日期：2015-11-12）

基金项目：国家自然科学基金（31070996）；国家自然科学基金（31171084）；国家自然科学基金（81371945）；国家自然科学基金（81101342）；国家重点基础研究计划（973项目）（2010CB833600）；北京市自然科学基金（7132133）

作者简介：程岩，硕士研究生，主要从事间充质干细胞生物学特性研究；张毅，研究员，博士生导师，主要从事细胞生物学研究；杨振林，主任医师，博士生导师，主要从事乳腺癌研究。

通讯作者：张 毅，E-mail：zhangyi612@hotmail.com，Tel：（010）66930315；杨振林，E-mail：yzhlin@126.com，Tel：（054）3258768